SC/T 7250.2-2025 鳖腮腺炎病诊断方法 第2部分：中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌

　　中华人民共和国水产行业标准

　　SC/T 7250.2—2025

　　鳖腮腺炎病诊断方法

　　第2部分：中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌

　　Diagnostic methods for Trionyx sinesis mumps— Part 2: Trionyx sinesis pathogenic Bacillus cereus

　　2025-12-09 发布

　　2026-05-01 实施

　　中华人民共和国农业农村部 发 布

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则 第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .

　　本文件是 SC/T 7250« 鳖腮腺炎病诊断方法»的第 2 部分 . SC/T 7250 已经发布了以下部分 :

　　— 第 1 部分 : 中华鳖出血综合征病毒 ;

　　— 第 2 部分 : 中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌 .

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .

　　本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出 .

　　本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC 156/SC 11)归 口 .

　　本文件起草单位 :浙江省淡水水产研究所 、浙江省农业科学院 、全国水产技术推广总站 、安徽省农业科学院 .

　　本文件主要起草人 :张海琪、刘莉、姚嘉赟、袁雪梅、陈静、吕孙建、林锋、焦锦彪、蒋业林、蔡晨旭、王根连、陈祝 、楼宝 、郭琦 .

　　引 言

　　鳖腮腺炎是近年来对鳖危害较大的一类疾病 ,能够引起鳖暴发性死亡。 鳖腮腺炎包括细菌性腮腺炎

　　— 第 1 部分 : 中华鳖出 血 综 合 征 病 毒。 目 的 在 于 描 述 中 华 鳖 出 血 综 合 征 病 毒 引 起 的 鳖 腮 腺 炎 的

　　诊断。

　　— 第 2 部分 : 中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌。 目的在于描述中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌引起的鳖腮

　　腺炎的诊断。

　　聂

　　鳖腮腺炎诊断方法

　　第 2 部分 : 中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌

　　1 范围

　　本文件描述了中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌引起的鳖腮腺炎诊断的试剂和材料 、仪器设备 、临床症状 、样品 、组织病理检查 、生理生化鉴定 、PCR检测及综合判定的方法 .

　　本文件适用于由中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌引起的鳖腮腺炎的诊断和流行病学调查 .

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 . 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版 本 适 用 于 本 文 件 ; 不 注 日 期 的 引 用 文 件 , 其 最 新 版 本(包 括 所 有 的 修 改 单)适 用 于 本

　　文件 .

　　GB/T 18088 出入境动物检疫采样

　　GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检验方法GB/T 28630 .4 白斑综合征(WSD)诊断规程SC/T 7011 .1 水生动物疾病术语与命名规则

　　SC/T 7011 .2 水生动物疾病术语与命名规则

　　SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范

　　第 4 部分 :组织病理学诊断法

　　第 1 部分 :水生动物疾病术语

　　第 2 部分 :水生动物疾病命名规则

　　3 术语与定义

　　SC/T 7011 .1 和 SC/T 7011 .2 界定的术语和定义适用于本文件 .

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 .

　　bp:碱基对(base pair)

　　DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　dNTPs:脱氧核苷三磷酸混合物(deoxyribonucleotide triphosphate mixture)

　　EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylene dia mine tetraacetic acid)

　　PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　Taq DNA 聚合酶 :水生栖热菌 DNA 聚合酶(Thermusaquaticus DNA polymerase)

　　TSA:胰酪大豆胨琼脂(tryptic soy agar)

　　TSB:胰酪大豆胨肉汤(tryptic soy broth)

　　SDS:十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)

　　5 试剂和材料

　　除非另有说明 ,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂 ,使用的水为蒸馏水 、无菌水 、去离子水或相当纯度的水 .

　　5 .1 琼脂糖 : 电泳级 ,常温保存 .

　　5 .2 电泳核酸染料 :溴化乙锭或其他等效试剂 , - 20 ℃保存 .

　　5 .3 氯仿/异戊醇混合液 :将氯仿(CHCl3)和异戊醇(C5 H12 O)按体积比 24 ∶ 1 混匀 ,4 ℃避光保存 .

　　5 .4 酚/氯仿/异戊醇混合液 :将 Tris饱和酚(C6 H6 O) 、氯仿(CHCl3)和异戊醇(C5 H12 O)按体积比 25 ∶ 24 ∶ 1 混匀 ,4 ℃避光保存 .

　　5 .5 异丙醇(C3 H8 O) :常温保存。

　　5 .6 DNA分子质量标准溶液 :1 000 bp~ 2 000 bp, - 20 ℃保存。

　　5 .7 MgCl2 (25 mmol/L) :常温保存。

　　5 .8 NaCl(5 mol/L) :常温保存。

　　5 .9 蛋白酶 K(C29 H27 N2 O12 P)(20 mg/mL) : - 20 ℃保存。

　　5 .10 RNaseA(50 (g/mL) : - 20 ℃保存。

　　5 .1 1 dNTPs(2 .5 mmol/L) :含 dATP、dTTP、dGTP和 dCTP各 2 .5 mmol/L的混合物 , - 20 ℃保存。

　　5 .12 Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) : - 20 (C保存。

　　5 .13 10×PCR缓冲液(不含 Mg2+ ) : 随 Taq DNA 聚合酶提供 , - 20 ℃保存。

　　5 .14 6×载样缓冲液 :常温保存。

　　5 .15 TSA培养基 :按了附录 A 的 A.1 配制。

　　5 .16 TSB培养基 :按 A.2 配制。

　　5 .17 石碳酸复红染色液 :按 A.3 配制。

　　5 .18 吕氏碱性美蓝染液 :按 A.4 配制。

　　5 .19 95%乙醇(C2 H6 O) :按 A.5 配制。

　　5 .20 75%乙醇(C2 H6 O) :按 A.6 配制。

　　5 .21 70%乙醇(C2 H6 O) :按 A.7 配制。

　　5 .22 1 ×TAE 电泳缓冲液 :按 A.8 配制。

　　5 .23 CTAB/NaCl:按 A.9 配制。

　　5 .24 TE缓冲液 :按 A.10 配制。

　　5 .25 10% SDS:按 A.11 配制。

　　5 .26 引物 HPBc_F(10 μmol/L) :5 ,_CTACAGGTCGCAGATAAAACAGTC_3 ,;引物 HPBc_R(10 μmol/L) :5 ,_GCAAGGGCTAAAAATGAAATCT_3 ,。

　　5 .27 阳性对照 :感染中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌的鳖组织 、中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌培养物或含目的片段的质粒 DNA。

　　5 .28 阴性对照 :未感染中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌的鳖组织 、其他革兰氏阳性菌培养物。

　　5 .29 空白对照 :无菌水。

　　6 仪器设备

　　6 .1 恒温培养箱。

　　6 .2 切片机。

　　6 .3 组织脱水机。

　　6 .4 包埋机。

　　6 .5 染色机。

　　6 .6 展片水浴锅。

　　6 .7 平板烘片机。

　　6 .8 封片机。

　　6 .9 水平电泳仪。

　　6 .10 普通 PCR仪。

　　6 .1 1 摇床 。

　　6 .12 紫外观察仪或凝胶成像仪 :波长范围 280 nm~ 320 nm。

　　6 .13 生物安全柜 .

　　6 .14 光学显微镜 .

　　6 .15 高速冷冻离心机 :转速 12 000 r/min以上 .

　　6 .16 微量移液器 :量程为 0 .1 μL~ 10 μL、10 μL~ 100 μL和 100 μL~ 1 000 μL.

　　7 临床症状

　　见附录 B.

　　8 样品

　　8 .1 采样对象

　　稚鳖 、幼鳖或成鳖 .

　　8 .2 采样部位

　　无菌采集肺脏 、脾脏 、肝脏 、肾脏和肠道组织样品 .

　　8 .3 采样数量

　　出入境动物检疫采样按 GB/T 18088 的规定执行 ,其他采样按 SC/T 7103 的规定执行 .

　　8 .4 保存和运输

　　用于组织病理检查的鳖样应活体送达实验室 ,及时取样检测 ;不用于组织病理检查的鳖样 ,应活体或冰鲜 24 h 内送达实验室 . 采样应加贴标签 ,标签上清楚标明样品编号 、采样时间 、采样地点 .

　　9 组织病理检查

　　9 .1 样品处理和观察

　　将纱布浸 75%乙醇(5 .20)后 ,覆盖于病鳖表面 ,或用含 70%乙醇(5 .21) 的棉球擦拭 , 打 开 鳖 背 壳 ,观察鳖咽喉及内脏 ; 取 肝 脏 、脾 脏 、肾 脏 和 肠 道 组 织 , 迅 速 切 成 厚 度 不 超 过 3 mm 的 组 织 块 , 按 GB/T 28630 .4 的方法进行组织固定 、脱水 、石 蜡 包 埋 、切 片 、苏 木 精 染 色 和 伊 红 染 色 、封 片 , 并 置 于 光 学 显 微镜下观察 .

　　鳖细菌性腮腺炎解剖学特征见 B.4 ,组织病理特征见 B.5 .

　　9 .2 结果判定

　　若观察到肝脏 、脾脏 、肠道均发现细胞核着色较浅有明显空洞甚至破损 , 即细胞核坏死 ,大量细菌在肝脏和脾脏中聚集 ,则判定为具有组织病理学特征 .

　　10 生理生化鉴定

　　10 .1 病原菌分离

　　用接种环或接种针(无菌)蘸取鳖的不同组织部位 ,分别划线接种于 TSA 培养基(5 .15)上 ,倒置于恒温培养箱 30 ℃ ±1 ℃培养 8 h~ 12 h.

　　10 .2 菌落的选取和纯化培养

　　TSA培养基上可见圆形乳白色凸起 ,融蜡状 ,表面光滑 ,边缘清晰整齐的菌落(见 B.6) . 挑取单菌落接种到 TSB培养基(5 .16) 中 ,并在 30 ℃ ±1 ℃ 、200 r/min的摇床中培养 12 h.

　　10 .3 革兰氏染色和形态观察

　　10 .3 .1 试验过程按 GB/T 18652 的规定执行 .

　　10 .3 .2 菌体形态为杆状 ,革兰氏染色阳性 .

　　10 .4 芽孢染色

　　10 .4 .1 用移液枪吸取几滴菌液制作涂片 , 自然干燥 ,通过火焰加热固定 .

　　10 .4 .2 滴加适量石碳酸复红染色液(5 .17)于涂片上 ,在酒精灯上加热 ,使染液冒蒸汽但不沸腾 . 必要时

　　可续加染液以免干涸 . 维持 4 min~ 5 min.

　　10 .4 .3 待标本冷却后用 95%乙醇(5 .19)冲洗至无红色染液脱出为止 ,水洗 .

　　10 .4 .4 滴加吕氏碱性美蓝染液(5 .18)复染 2 min~ 3 min,水洗至无染液脱出为止 .

　　10 .4 .5 待干后油镜观察 .

　　10 .4 .6 菌体呈蓝色 ,形态为杆状 ,芽孢呈红色 ,判定该菌为芽孢杆菌 ,特征见 B.6 .

　　10 .5 生化试验

　　10 .5 .1 挑选革兰氏染色阳性 、具有芽孢的菌落 ,进一步做生化鉴定 .

　　10 .5 .2 按照附录 C动力 、明胶液化 、甘露醇发酵 、溶菌酶和硝酸盐还原试验过程进行 .

　　10 .5 .3 生化鉴定结果按附录 C判定 .

　　10 .5 .4 利用全自动细菌分析仪或细菌生化鉴定管可简化相应试验过程 .

　　1 1 PCR检测

　　1 1 .1 细菌 DNA提取

　　1 1 .1 .1 分别挑取 TSA培养基上生长的样品分离菌 、阳性对照(5 .27)和阴性对照(5 .28) 的单菌落 ,接种于 5 mL TSB培养基 ,28 ℃培养过夜 .

　　1 1 .1 .2 取 1 mL菌液 2 296 g离心 10 min,弃去上清 ,用 1 mL无菌水重悬 ,作为种子培养液 .

　　1 1 .1 .3 将 1 mL种子培养液加入 100 mL TSB 中 ,并在 28 ℃ 、220 r/min的摇床中培养 16 h.

　　1 1 .1 .4 以 5 000 r/min的速度离心 10 min,并丢弃上清液 .

　　1 1 .1 .5 加入 10 mL TE缓冲液(5 .24)进行离心和洗涤后 ,用 10 mL TE缓冲液溶解细菌 ,充分混合 .

　　1 1 .1 .6 取 3 .5 mL细菌悬浮液 ,并添加 184 μL 10% SDS(5 .25)混合均匀 ,加 37 μL蛋白酶 K(5 .9) ,混合均匀 ,在 37 ℃孵育 1 h.

　　1 1 .1 .7 加 入 740 μL NaCl(5 .8) , 然 后 加 入 512 μL CTAB/NaCl(5 .23) , 充 分 混 合 , 并 在 65 ℃孵 育10 min.

　　1 1 .1 .8 加入等体积的氯仿/异戊醇混合液(5 .3) ,混合均匀 , 以 10 000 r/min 的速度离心 5 min,然后保存上清液 .

　　1 1 .1 .9 在上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液(5 .4) ,混合均匀 , 以 10 000 r/min离心 5 min,然后保存上清液 .

　　1 1 .1 .10 加入 0 .6 倍体积的异丙醇(5 .5) ,混合均匀 , 以 10 000 r/min离心 5 min, 收集 DNA 沉淀物 ,并用 70%乙醇离心洗涤 DNA沉淀物 .

　　1 1 .1 .1 1 用 1 mL TE溶解 DNA,加入 RNaseA(5 .10)至终浓度 20 μg/mL,并在 4 ℃下保存 .

　　注 :商业化的细菌 DNA提取试剂盒均可应用于本文件 .

　　1 1 .2 组织 DNA提取

　　1 1 .2 .1 对于病鳖组织样品 ,取肝 、脾 、肾等组织匀浆后 ,取 20 mg~ 50 mg组织匀浆液作为含菌样品 ,参照 11 .1 提取 DNA.

　　1 1 .2 .2 提取过程同时设置阳性对照 、阴性对照和空白对照(5 .29) .

　　注 :商业化的细菌 DNA提取试剂盒均可应用于本文件 .

　　1 1 .3 PCR扩增

　　每个样品按照表 1 的要求 ,加入除 Taq DNA 聚 合 酶 以 外 的 各 项 试 剂 , 在 冰 盒 上 配 制 成 预 混 物 , 保

　　存于- 20 ℃ . 临 用 前 , 加 入 相 应 体 积 的 Taq DNA 聚 合 酶 ( 5 .12) , 混 匀 , 按 照 45 μL/反 应 分 装 到

　　以 下 程 序 进 行 PCR 扩 增 : 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 35 个 循 环 ; 72 ℃ 10 min,

　　4 ℃保 存 .

　　注 :商业化的 PCR试剂盒均可应用于本文件 .

　　表 1 PCR预混物试剂组成

　　1 1 .4 琼脂糖凝胶电泳

　　1 1 .4 .1 用 1×TAE(5 .22)电泳缓冲液配制 1 .5%的琼脂糖(5 .1)凝胶 ,加热至完全溶解 ,待冷却至 60 ℃左右 ,按比例加入核酸染料 ,制备琼脂糖凝胶。

　　1 1 .4 .2 将制备好的琼脂糖凝胶置入水平电泳槽 ,加样孔应朝向负极 ,加入 1 × TAE 电泳缓冲液至没过

　　胶面。 将 5 μLPCR反应产物与 1 μL6×载样缓冲液(5 .14)混匀后加入到加样孔中 , 同时设立 DNA分子

　　质量标准溶液(5 .6)对照。

　　1 1 .4 .3 在水平电泳仪 5 V/cm 的电压下电泳约 0 .5 h, 当载样缓冲液中的溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的 2/3 处时停止电泳 ,将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪上观察或拍照记录。

　　1 1 .4 .4 如观察到预期大小扩增片段 ,对 PCR扩增产物进行测序 ,并对测序结果进行序列比对。

　　1 1 .5 结果判定

　　1 1 .5 .1 若阳性对照在 680 bp处有条带 , 阴性对照在 680 bp处无条带 ,空白对照无任何条带 ,检测有效。

　　1 1 .5 .2 若样品 PCR扩增在 680 bp处无条带 ,则判定 PCR检测结果为阴性。

　　1 1 .5 .3 若样品 PCR扩增在 680 bp处有条带 ,需要回收 PCR产物测序 ,测序结果与附录 D参考序列 一致性 >98 .24% ,则判定 PCR检测结果为阳性 ,否则 PCR结果判定为阴性。

　　12 综合判定

　　12 .1 疑似病例的判定

　　鳖样品符合以下任何一项 ,判定为疑似病例 :

　　a) 出现临床症状 ,具有组织病理学特征 ;

　　b) 内脏组织分离出菌 ,具备蜡样芽孢杆菌的生理生化特征 ;

　　c) PCR检测结果为阳性。

　　12 .2 确诊病例的判定

　　鳖样品出现临床症状 ,且符合以下任何一项 ,判定为确诊病例 :

　　a) 具有组织病理学特征 , 内脏组织分离出菌 ,符合蜡样芽孢杆菌的生理生化特征 ;

　　b) PCR检测结果为阳性。

　　附 录 A

　　(规范性)

　　试剂及其配制

　　A.1 TSA培养基

　　胰蛋白胨 15 .0 g

　　大豆木瓜蛋白酶消化物 5 .0 g

　　氯化钠 5 .0 g

　　琼脂 15 .0 g

　　加热搅拌溶解于 1 000 mL水中 ,调节 pH 至 7 .3±0 .2 ,分装于容器中 ,121 ℃高压灭菌 15 min,灭菌后取出培养基 ,冷却至 60 ℃左右 ,倾倒细菌培养皿 ,备用 .

　　A.2 TSB培养基

　　胰蛋白胨 15 .0 g

　　大豆木瓜蛋白酶消化物 5 .0 g

　　氯化钠 5 .0 g

　　加热溶解于 1 000 mL水中 ,调节 pH 至 7 .3±0 .2 ,分装于容器中 ,121 ℃高压灭菌 15 min,备用 .

　　A.3 石碳酸复红染色液

　　碱性复红 0 .3 g

　　石碳酸 5 .0 g

　　将 0 .3 g碱性复红溶解于 10 mL 95%乙醇配制成 A液 ;再将 5 .0 g石碳酸溶解于 95 mL水配制成 B液 ;将 A液和 B液配好后混合 ,备用 .

　　A.4 吕氏碱性美蓝染液

　　美蓝 0 .6 g

　　KOH 0 .01 g

　　将 0 .6 g美蓝溶解于 30 mL 95%乙醇配制成 A液 ;0 .01 g KOH 溶解于 100 mL水中配制成 B液 ;将A液和 B液配好后混合 ,备用 .

　　A.5 95%乙醇

　　无水乙醇 95 mL

　　加水混匀 ,定容至 100 mL.

　　A.6 75%乙醇

　　无水乙醇 75 mL

　　加水混匀 ,定容至 100 mL.

　　A.7 70%乙醇

　　无水乙醇 70 mL

　　加水混匀 ,定容至 100 mL.

　　A.8 1×TAE 电泳缓冲液

　　Tris 242 g

　　冰乙酸 57 .1 mL

　　.o容l/,0成) 50×TAE 电泳缓冲液。 100 mL

　　50×TAE 电泳缓冲液 20 mL

　　加水定容至 1 000 mL,室温储存。

　　A.9 CTAB/NaCl

　　NaCl 4 .1 g

　　CTAB 10 g

　　加水 80 mL,混匀 ,必要时可以 65 ℃加热促溶 ,冷却至室温后 ,加水定容至 100 mL,高压灭菌 15 min,室温保存。

　　A.10 TE 缓冲液

　　.o匀l/L,5(.,)压灭菌 15 min,室温保存。1 mL

　　A.1 1 10% SDS溶液

　　十二烷基硫酸钠 10 g

　　加水 80 mL,混匀 ,调节 pH 至 7 .2±0 .2 ,然后将溶液定容至 100 mL,室温保存。

　　附 录 B

　　(资料性)

　　鳖细菌性腮腺炎病

　　B.1 疾病描述

　　由中华鳖蜡样芽孢杆菌引起的鳖腮腺炎是一种严重危害中华鳖的细菌性疾病 ,其临床症状与病毒性

　　治疗 ,死亡率可达 60%以上。 该病具有较强的传染性和致死性 ,并在 2022 年农业农村部发布的最新« 一 、

　　二 、三类动物疫病病种名录»中 ,被列为三类动物疫病。

　　B.2 病原

　　细菌性鳖腮腺炎病原为中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌(Trionyx sinensis pathogenic Bacilluscereus) 。该细菌 16S rDNA鉴定与蜡样芽孢杆菌 、苏云金杆菌等有较高的同源性 ;生理生化鉴定为蜡样芽孢杆菌 ;全基因组测序分析发现 ,除染色体基因组外 ,还包含两个不同大小的质粒基因组。

　　B.3 易感宿主

　　易感宿主为鳖 ,包括中华鳖日本品系 、清溪乌鳖等。 病原可感染稚鳖 、幼鳖和成鳖 ;病原菌芽孢在环境

　　条件难以彻底清除 , 已感染的养殖场易反复发病。

　　B.4 临床症状

　　病鳖临床主要表现为活力变差 ,在水面无力浮游 ,脖子伸长或扭曲 ,不断摇头 ,食欲减退 ,严重时完全不吃食 ;剖检可见鳖 咽 喉 部 红 肿 , 肠 壁 和 肺 充 血 , 肝 易 碎 无 弹 性 , 部 分 有 失 血 现 象 , 但 无 淤 血 点 现 象( 图B.1) 。

　　标引序号说明 :

　　1 — 患细菌性腮腺炎鳖脖子伸长 ,软弱无力 ;

　　2 — 患细菌性腮腺炎鳖肠道组织严重充血 ;

　　3 — 患细菌性腮腺炎鳖咽喉部黏膜充血。

　　图 B.1 患细菌性腮腺炎鳖临床特征

　　B.5 组织病理学

　　在 20 倍光学显微镜下可观察到 ,感染致病性蜡样芽孢杆菌的中华鳖肝脏 、脾脏 、肠道均可见细胞核着

　　色较浅有明显空洞甚至破损 , 即细胞核坏死 ,并且肝细胞间边界模糊 ,细胞受损较为严重 ,大量蜡样芽孢杆

　　菌在肝脏和脾脏中聚集。 其中肾脏相较于上述 3 个部位情况较轻 ,但也有病变可见 ,两者细胞质均着色较

　　标引序号说明 :

　　1 — 细菌聚集 ;

　　2 — 细胞质空泡化 ;

　　3 — 淋巴滤泡萎缩和坏死 ;

　　4 — 肾小管坏死 ;

　　5 — 肾小球淋巴细胞浸润和萎缩 ;

　　6 — 绒毛固有层结构紊乱 ,平滑肌松弛 ;

　　7 — 中央乳糜管受损。

　　图 B.2 病鳖的组织病理学特征

　　B.6 细菌分离及染色鉴定

　　从临床症状典型的中华鳖肝 、肾 、脾 、肺等内脏组织中分离形态特征一致的优势菌落进行纯化培养 ,30 ℃培养 12 h,观察菌落特征 ,并经革兰氏染 色 鉴 定 , 呈 阳 性 , 芽 孢 染 色 后 镜 检 观 察 芽 孢 大 多 为 顶 端 生(图B.3) 。

　　a ) 分离菌的形态观察 b ) 细菌的芽孢染色图

　　标引序号说明 :

　　1 — 芽孢染色鉴定观察细菌具有芽孢。

　　图 B.3 患细菌性腮腺炎鳖细菌的分离及芽孢染色鉴定

　　附 录 C (规范性)生化试验

　　C.1 动力试验

　　挑取单个可疑菌落按间隔 2 cm~ 3 cm 距离划平行直线于经室温干燥 1 d~ 2 d 的营养琼脂平板上 ,

　　30 ℃ ±1 ℃培养 24 h~48 h,不能超过 72 h。有动力的细菌(阳性)沿穿刺线呈扩散生长 ,无动力的细菌

　　(阴性)呈绒毛状生长。

　　C.2 明胶液化试验

　　挑取可疑菌落接种于明胶培养基中 ,36 ℃ ±1 ℃培养 24 h±2 h,取出 ,2 ℃ ~ 8 ℃放置 30 min,取出 ,

　　观察明胶液化情况。 在培养基平板的菌落上滴加试剂 ,若为阳性 ,10 min~ 20 min后 ,菌落周围应出现清

　　晰带环 ,否则为阴性。

　　C.3 甘露醇发酵试验

　　将待检菌株接种于甘露醇发酵培养基中 ,35 ℃孵育 24 h后 ,观察结果。 若培养基颜色变为黄色则甘

　　露醇发酵试验为阳性 ,否则为阴性。

　　C.4 溶菌酶试验

　　用接种环取纯菌悬液一环 ,接种于溶菌酶肉汤培养基(含 0 .001%溶菌酶)中 ,36 ℃ ± 1 ℃培养 24 h。

　　若细菌能在本培养基中生长 ,则为阳性 ;若不能生长 ,则为阴性。

　　C.5 硝酸盐还原试验

　　将细菌接种于硝酸盐肉汤培养基中 ,在 36 ℃ ±1 ℃培养 24 h~ 72 h,加甲液(对氨基苯磺酸 0 .8 g溶

　　解于 2 .5 mol/L乙酸溶液 100 mL 中)和乙液(甲萘胺 0 .5 g溶解于 2 .5 mol/L乙酸溶液 100 mL 中)各 1

　　滴 ,观察结果 , 阳性反应立即或数分钟内显红色。 若为阴性 ,可再加入锌粉少许 , 出现红色 ,表示硝酸盐未

　　被还原 ,为阴性 ;反之 ,则表示硝酸盐已被还原 ,为阳性。

　　C.6 判定结果

　　表 C.1 给出了本文件生化试验结果判定依据。

　　表 C.1 不同芽孢杆菌的生化特性

　　附 录 D

　　(资料性)

　　中华鳖蜡样芽孢杆菌 PCR检测产物及引物序列

　　1 GCAAGGGCTA AAAATGAAAT CTCAGTTTCA TGTAATGTAA CGCCGAAAGA GTTTTGTAGC HPBc-F

　　61 TCTGGGGTTA TAGACGATAC TGTTTTATAA TGATCATCAT TTTTATTTAC TAAAATAAGT

　　121 CCACTTACAT TATCTATTGT ATTTCCTGAT AGTAATCTGG AGATTGTTAT AGCGAACAAA

　　181 ACACACAATT TGTGTTTTGA ATAAGTGTAC ATTTGTACAT CTAAATTTTT TTCCATTTTA

　　241 TTAATTAGAT CAGTGATATT TTGTTTATTA ATATAGGGAA ACGGCCAATA ATCATTTGGA

　　301 ATATTGCAAT ATAACCTTAA CATAAATACG CGGACATCTT GTTCTCTTCC CGATATTTCT

　　361 AGAGGTTTTT TTTTGATATT TAAATGACTT GACTGTATAT CATAATTTAT TTGATTAATA

　　421 ATTGGATATA AAGCTCCTAC TTGTAAGTGG AGCTTTTGAG CTAAGGATTG CATACTGTTT

　　481 TTTTTGAATA CAAGTTCTTC GCAAATTTGA AGATTTAGTG ATTTTCTTAA AATTTTTGAT

　　541 TCAACAAAGG AAGGGGATTC ATTTAATGGT TTTTTTAGAT AAATTCCTTT TCCTTTTTGA

　　601 ACAAGTAAAT TCCAAGATGG AGGAATTTCG TCTTCTAATA ATTTTAAATA TTTTCGGACT 661 GTTTTATCTG CGACCTGTAG

　　HPBc-R