NY/T 4801-2025 非洲菊隐地疫霉检测 实时荧光定量PCR法

　　中华人民共和国农业行业标准

　　NY/T 4801—2025

　　非洲菊隐地疫霉检测 实时荧光定量PCR法

　　Detection of Phytophthora cryptogea in gerbera— Real-time fluorescent quantitative PCR method

　　2025-12-09 发布

　　2026-05-01 实施

　　中华人民共和国农业农村部 发 布

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则 第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .

　　本文件由农业农村部种植业管理司提出并归 口 .

　　本文件起草单位 :云南省 农 业 科 学 院 花 卉 研 究 所 、全 国 农 业 技 术 推 广 服 务 中 心 、昆 明 市 农 业 科 学 研究院 .

　　本文件主要起草人 :王丽花 、张颢 、瞿素萍 、杨秀梅 、李绅崇 、左文天 、邱显钦 、孙爱青 、冯德党 、黄望启 、苏艳 、张艺萍 、张丽芳 、许凤 .

　　非洲菊隐地疫霉检测 实时荧光定量 PCR法

　　1 范围

　　本文件描述了非洲菊隐地疫霉(Phytophthora cryptogea Pethybr.& Laff.) 实时荧光定量 PCR检测

　　的原理 、仪器和设备 、试剂与耗材 、样品制备与存放 、试验步骤 、结果判定及试验数据处理的技术要求。

　　本文件适用于非洲菊(GerberajamesoniiBolus)植株隐地疫霉的检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版 本 适 用 于 本 文 件 ; 不 注 日 期 的 引 用 文 件 , 其 最 新 版 本(包 括 所 有 的 修 改 单)适 用 于 本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　NY/T 3629—2020 马铃薯黑胫病和软腐病菌 PCR检测方法

　　NY/T 4430—2023 香石竹斑驳病毒的检测 荧光定量 PCR法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3 .1

　　Ypt1 基因 Ras related protein 1 gene

　　三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因 ,具有高度保守的外显子和多个高度可变的内含子 ,其基因序列保守区和进化区相互间隔。

　　3 .2

　　Taq Man探针 Taq Man probe

　　一种检测寡核苷酸的荧光探针 ,其 5 9末端携带荧光基团(可选 FAM、TET、VIC、HEX等) ,3 9端携带淬灭基团(如 TAMRA、BHQ等)。

　　[来源 :NY/T 4430—2023 ,3 .2]

　　3 .3

　　实时荧光定量聚合酶链式反应 realtime fluorescentquantitativePCR

　　利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程 ,并通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

　　3 .4

　　Ct值 cycle threshold value

　　每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

　　3 .5

　　质粒标准品 plasmid referencemolecule

　　一种包含目标靶基因的重组质粒分子 ,可用于病原菌等定性定量检测时的标准曲线构建。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) 。

　　Tris:三 (羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl) aminomethane]。

　　FAM : 6 羧基荧光素( 6carboxyfluorescein) 。

　　bp:碱基对(base pair)。

　　5 原理

　　利用隐地疫霉菌(见附录 A)Yfit1 基因的高度保守区域设计特异性引物和 Taq Man 探针 ,构建靶标阳性重组质粒 ,建立标准曲线及相应线性方程 ,根据实时荧光 PCR检测 Ct值开展隐地疫霉菌的定性或定量判定。

　　6 仪器和设备

　　6 .1 实时荧光定量 PCR仪。

　　6 .2 热循环仪。

　　6 .3 电泳仪。

　　6 .4 水平电泳槽。

　　6 .5 凝胶成像系统(波长 302 nm 或 365 nm) 。

　　6 .6 超微量紫外可见光分光光度计(波长 190 nm~ 840 nm) 。

　　6 .7 高速冷冻离心机 :离心力 12 000 g 以上 ,工作温度- 5 ℃ ~30 ℃ 。

　　6 .8 高压灭菌锅。

　　6 .9 超低温冰箱 : - 80 ℃ 。

　　6 .10 冰箱 :2 ℃ ~ 8 ℃ , - 20 ℃ ~ - 15 ℃ 。

　　6 .1 1 微量移液器 :量程分别为 0 .1 μL~2 .5 μL,0 .5 μL~10 μL,5 μL~20 μL,10 μL~100 μL,20 μL~ 200 μL,100 μL~1000 μL。

　　6 .12 电子天平 :感量为 0 .01 g。

　　6 .13 生物安全柜 :洁净度 100 级以上。

　　6 .14 超净工作台 :洁净度 100 级以上。

　　7 试剂与耗材

　　7 .1 要求

　　除特别说明外 ,在检测中应使用分析纯或化学纯试剂 ,所有试剂均应用无 RNA 酶的容器分装 ;实验用水应符合 GB/T 6682 规定的二级水指标 ,其中涉及 PCR扩增的用水为无 RNA酶的 ddH2 O。

　　7 .2 引物及探针

　　引物及 Taq Man探针序列见表 1 。

　　表 1 引物探针序列

　　7 .3 试剂

　　7 .3 .1 市售商品化植物基因组 DNA提取试剂盒。

　　7 .3 .2 dNTP 混合物( 浓度为 2 .5 mmol/L,pH 7 .5) 。

　　7 .3 .3 Taq DNA 聚合酶(5 U/μL ) .

　　7 .3 .4 10×PCR缓冲液(含 Mg2+ ) .

　　7 .3 .5 10×TAE 电泳缓冲液 .

　　7 .3 .6 GeneGreen核酸染料 .

　　7 .3 .7 500 bp DNA分子量标准物 .

　　7 .3 .8 1%琼脂糖凝胶 .

　　7 .3 .9 实时荧光定量 PCR扩增混合液

　　含有 Premix ExTaq聚合酶(5 U/μL) 、上游引物(20 μmol/L) 、下游引物(20 μmol/L) 、Taq Man探针 (10 μmol/L) 、无 RNA酶 ddH2 O及模板的混合液 .

　　7 .4 耗材

　　DNA提取 吸 附 柱 及 套 管 、实 时 荧 光 定 量 PCR 专 用 8 联 管 及 管 盖 或 96 孔 板 、各 量 程 微 量 枪 头(2 .5 μL、10 μL、200 μL、1 000 μL) .

　　8 样品制备与存放

　　8 .1 取样和样品制备

　　样品流水冲洗干净后用灭菌滤纸吸干水分 ,植株取根颈部位组织 ,组培苗取全株 ,剪碎后置于一次性自封袋中 . 设立阳性对照和空白对照 , 阳性对照为感染隐地疫霉的非洲菊样品 ,空白对照为无 RNA 酶的ddH2 O.

　　8 .2 样品存放

　　温冰品,1~,免,超过 24 h;中长期保存时置于- 80 ℃的超低

　　8 .3 剩余样品处理

　　剩余样品或无需保存的样品及时做高压灭菌等无害化处理 .

　　9 试验步骤

　　9.1 基因组 DNA提取与质量判定

　　9.1 .1 基因组 DNA提取

　　按 NY/T 3629—2020 中 6 .3 的要 求 或 市 售 商 品 化 植 物 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 方 法 提 取 基 因 组DNA.

　　9.1 .2 基因组 DNA提取质量及浓度的判定

　　通过以下任一方法进行判定 :

　　a) 在超微量紫外可见光分光光度计上测定样品基因组 DNA 的光吸收值及浓度 , 当 A260/A280 比值在 1 .8 ~ 2 .0 时 ,判定提取的 DNA质量符合后续实时荧光定量 PCR 的扩增要求 .

　　b) 通过电泳和凝胶成像系统观察条带的方法判定基因组 DNA 质量及浓度 , 电泳后仅出现一条亮度高的条带 ,且上下无拖尾 ,点样孔内或附近无蛋白残留 ,判定提取的 DNA 质量好纯度高 ,符合后续实时荧光定量 PCR 的扩增要求 .

　　9.2 实时荧光定量 PCR检测

　　9.2 .1 对照设置

　　阳性对照 :9 .1 .1 提取的阳性样品 DNA或含有经 7 .2 引物探针扩增的隐地疫霉 Yfit1 基因片段的重组质粒 DNA(见附录 B) ,拷贝数为 1 × 104 个/μL.

　　空白对照 :无 RNA酶 ddH2 O.

　　9.2 .2 反应液配制

　　在超净工作台或生物安全柜中取出实时荧光定量 PCR反应所需试剂 ,冰上融化后 ,根据检测样品数

　　量配制扩增反应液 ,反应液组分见表 2 .

　　表 2 实时荧光定量 PCR扩增反应混合液配制组分

　　9 .2 .3 反应程序设置

　　反应程序为 :95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40 个循环 .

　　9 .3 标准曲线构建

　　9 .3 .1 质粒标准品的制备见附录 B.

　　9 .3 .2 精密度

　　制备标准曲线需设置 6 个 ~ 8 个质粒梯度稀释浓度 ,每浓度应做 3 个 ~ 5 个平行重复 ,且各质粒稀释浓度的扩增 Ct值在 12 ~ 38 . 同浓度平行间 Ct值相差应 ≤0 .3 ,不同浓度平均 Ct值相差应 ≤3 .3 .

　　9 .3 .3 梯度浓度质粒标准品制备

　　阳性质粒标准品母液按 10 倍梯度稀释 ,依次稀释至 5×10- 1 拷贝/μL,获得 10 个浓度梯度的质粒标准品 , 即 5×10 8 拷贝/μL、5×10 7 拷贝/μL、5×106 拷贝/μL、5×105 拷贝/μL、5×104 拷贝/μL、5×103 拷贝/μL、 5×10 2 拷贝/μL、5×10 1 拷贝/μL、5×10 0 拷贝/μL及 5×10- 1 拷贝/μL.

　　9 .3 .4 构建标准曲线

　　以无 RNA酶 ddH2 O为空白对照 , 以 9 .3 .3 中制备的 8个梯度浓度(5×107 拷贝/μL、5×106 拷贝/μL、 5×10 5 拷贝/μL、5×10 4 拷贝/μL、5×10 3 拷贝/μL、5×10 2 拷贝/μL、5×10 1 拷贝/μL、5×10 0 拷贝/μL)质粒标准品为模板 ,每个梯度浓度设置 3 个重复 ,按 9 .2 .2 配制体系后采用 9 .2 .3 反应程序进行扩增 ,构建标准曲线 . 以 log10 (质粒拷贝数)(lgC)为横坐标(x) , 以循环阈值(Ct值)为纵坐标(y) ,作图并生成标准线性回归方程 . 标准曲线示例见附录 C.

　　10 结果判定及试验数据处理

　　10 .1 有效判定原则

　　阳性对照的 Ct值应 ≤30 .0 ,并出现典型的扩增曲线 , 空白对照无 Ct值 ,则检测结果视为有效 , 否则检测结果视为无效 ,应重新进行检测 . 典型的扩增曲线见附录 D.

　　10 .2 结果判定

　　阳性对照有典型扩增曲线 ,空白对照无扩增曲线 ,待检测样品有典型扩增曲线且 Ct值 ≤ 30 .0 ,判定该样品检出隐地疫霉菌 .

　　阳性对照有典型扩增曲线 ,空白对照无扩增曲线 ,待检测样品有扩增曲线但 Ct值 > 35 .0 ,判定该样品未检出隐地疫霉 .

　　阳性对照有典型扩增曲线 ,空白对照无扩增曲线 ,待检测样品扩增曲线 Ct值介于 30 .1 ~ 35 .0 ,则需再次试验 . 若重复实验的结果出现典型的扩增曲线 ,检测 Ct值仍然介于 30 .1 ~ 35 .0 或 ≤ 30 .0 ,则判定样品检出隐地疫霉 ;若重新测试的 Ct值 > 35 .0 ,则判定该样品未检出隐地疫霉 .

　　10 .3 样品携带病原菌拷贝数计算

　　把样品检测的 Ct值代入标准曲线线性方程 ,计算出 目的基因起始模板的拷贝数 , 即样品携带病原菌拷贝数 ,式中 y 为 Ct值 ,x 为病原菌浓度的对数值 .

　　附 录 A

　　(资料性)

　　非洲菊隐地疫霉基本信息

　　A.1 病原菌分类地位

　　非洲菊疫病的病原菌为隐地疫霉(Phytophthoracryptogea Pethybr.& Laff.) ,属藻界(Chromistan)卵菌门(Oomycota)卵菌纲(Oomycetes)霜霉目(Peronosporales)霜霉科(Peronosporaceae)疫霉属(PhyG tophthora)病原菌。

　　A.2 病害症状特征

　　症状从植株基部开始发生 ,发病初期地上部分失水卷曲 、萎蔫 ,易拔起 ;受害根部或叶柄基部变软 、水

　　渍状 ,变褐腐烂呈撕裂状 ,皮层脱落 ; 叶片由绿色转为暗紫红色 ,后变为褐色 ,最后整株枯萎死亡。 湿度大

　　时 ,病部表面长出稀疏的白色霉状物 , 即病原菌的菌丝体 、孢囊梗和孢子囊。

　　A.3 传播途径

　　病菌以卵孢子随病残体在土壤中越冬 ,次年借雨水飞溅到寄主上 ,从近地面的茎基部侵染 , 向下延伸到根部。 在高湿环境或排水不良的低洼处形成白色绵毛状霉 ,产生大量菌丝和孢子囊 ,借风雨或水流传播。

　　附 录 B

　　(资料性)

　　质粒标准品的制备

　　B.1 目的基因片段扩增

　　以感染隐地疫霉的植株样品提取的 DNA为模板 ,利用 Ypt1 基因的正反向引物对 P.cryF/P.cryR扩

　　增目的基 因 片 段 , PCR 反 应 体 系 25 μL: dNTP Mixture(2 .5 mmol/L) 2 .5 μL、10 × Ex Taq buffer(20

　　mmol/L)2 .5 μL、ExTaq(5 U/μL) 0 .25 μL、模 板 DNA 2 μL、P.cryF(10 μmol/L) 0 .5 μL、P.cryR(10

　　μmol/L)0 .5 μL、无 RNA酶 ddH2 O 16 .75 μL。反应程序为 :95 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s,58 ℃

　　比对验证确为目的基因。

　　B.2 产物胶回收及纯化

　　PCR产物经胶回收纯化后 ,将回收产物克隆至 pMDTM 19T载体并转化至 DH5a感受态细胞中 ,筛选并提取阳性克隆的质粒并测序验证。

　　B.3 阳性质粒酶切线性化

　　将 B.2 获得的阳性质粒用 Hind Ⅲ酶切线性化后 ,并经胶回收提纯 ,后用超微量紫外可见光分光光度计 (波长 340 nm)测定浓度 ,置于- 20 ℃保存备用。

　　B.4 阳性质粒拷贝数换算

　　阳性质粒按公式(B.1)换算出质粒拷贝数 ,后稀释为 5×10 9 拷贝/μL的质粒标准品作为母液 ,置于? 20 ℃ 保存备用 ,保存时间不超过 3 个月 ,长期保存时应置于? 80 ℃ 超低温冰箱。

　　式中 :

　　C — 质粒拷贝数的数值 ,单位为拷贝(μL) ;

　　NA — 阿伏伽德罗常数 ,通常表示为 6 .02×10 23 个/ mol;

　　ρ — 质粒浓度的数值 ,单位为纳克每微升(ng/μL) ;

　　ω — 质粒平均分子量的数值 ,单位为纳克每摩尔(ng/ mol) 。

　　附 录 C

　　(资料性)

　　检测靶基因标准曲线示例

　　108 拷贝 、107 拷贝 、10 6 拷贝 、105 拷贝 、104 拷贝 、103 拷贝 、102 拷贝 、10 1 拷贝的隐地疫霉 Yfit1 基因质粒标准 品 扩 增 标 准 曲 线 见 图 C.1 , 标 准 曲 线 线 性 方 程 为 y = - 3 .323x + 40 .767 (R2 = 0 .998 , E=

　　标引序号说明 :

　　a— 10 8 拷贝 ;

　　b— 10 7 拷贝 ;

　　c— 10 6 拷贝 ;

　　d— 10 5 拷贝 ;

　　e— 10 4 拷贝 ;

　　f— 10 3 拷贝 ;

　　g— 10 2 拷贝 ;

　　h— 10 1 拷贝。

　　i— 无 RNA酶 ddH2 O

　　图 C.1 非洲菊隐地疫霉 YPT1 基因扩增标准曲线

　　附 录 D

　　(资料性)

　　典型的实时荧光定量 PCR检测扩增曲线

　　典型的实时荧光定量 PCR检测扩增曲线见图 D.1 ,其中 b和 c为检出隐地疫霉 ,d为未检出隐地疫霉。

　　扩增曲线

　　15

　　. 10

　　5

　　a b C

　　0 de

　　0 10 20 30 40

　　循环数

　　标引序号说明 :

　　a— 阳性样品 ;

　　b— 隐地疫霉菌株样品 ;

　　c— 感病非洲菊植株样品 ;

　　d— 非洲菊组培苗样品 ;

　　e— 无 RNA酶 ddH2 O。

　　图 D.1 典型的实时荧光定量 PCR检测扩增曲线

　　参 考 文 献

　　[1 ] GB/T 19495 .3—2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法

　　[2 ] GB/T 19495 .5—2018 转基因产品检测 实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法

　　[3 ] NY/T 1281—2007 花卉植物真菌病害检测规程