T/CATAGS 72-2023 航空燃料中微生物污染测试（培养法）

　　ICS 03.220.50 A 21

　　T/CATAGS

　　中 国 航 空 运 输 协 会 团 体 标 准

　　T/CATAGS 72—2023

　　航空燃料中微生物污染测试(培养法)

　　Testing of microbial contamination in aviation fuel - Culture Method

　　2023 - 12 - 27 发布

　　2023 - 12 - 27 实施

　　中国航空运输协会 发 布

　　前 言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　本文件由中国航空运输协会提出并归口。

　　本文件起草单位：中国民用航空局第二研究所、中国航空油料有限责任公司。

　　本文件主要起草人：仇义霞、肖勇、黄俊、黄怡程、聂颖恬、王文武、李志强

　　航空燃料中微生物污染测试(培养法)

　　1 范围

　　本文件规定了使用凝胶培养基培养法在实验室条件下测定航空燃料中微生物含量。本方法测定航空

　　燃料中油相时，检测范围为 0 CFU/L~10000000 CFU/L;测定航空燃料中水相时，检测范围为 0 CFU/mL~1000000 CFU/mL。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件。

　　3 术语与定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　微生物 Microorganisms

　　在有氧条件下，能够在培养基中生长的细菌和真菌(酵母菌和霉菌)。

　　3.2

　　菌落 Colony

　　可繁殖微生物或者含可繁殖微生物的颗粒，被接种到培养基中，逐渐繁殖形成的微小可见的微生物聚集体。

　　4 方法概要

　　将一定体积待测样品加入到装有凝胶培养基的玻璃瓶(6.1)中，摇晃玻璃瓶，使样品与培养基混合均匀。随后，将培养基在玻璃瓶的其中一个最大面上重新铺展成一平面，再将该玻璃瓶放在恒温避光环境中培育。培育一段时间后，培养基中呈现出肉眼可见的红色或者紫红色菌落斑点。以CFU 为单位表示微生物的菌落数量，形成菌落的数量与测试样品体积有关，以 CFU/L 为单位表示油相中微生物含量，或者以 CFU/mL 为单位表示水相中微生物含量。

　　5 材料与试剂

　　5.1 培养基

　　培养基为凝胶培养基，含有能够维持液体燃料中多种微生物生长的营养物质和对菌落进行染色的反应性化合物。

　　5.1.1 将适量琼脂、黄原胶、卡拉胶等放入1L水中溶解并煮沸。

　　5.1.2 加入1mol/L的盐酸溶液或者质量分数为10% 的NaOH水溶液，使其pH值为7.3±0.2。

　　5.1.3 取250 mL琼脂混合物液体到500 mL玻璃瓶中，盖上盖子，放入温度为121±2 ℃的压力反应釜中灭菌15min，室温下冷却。

　　5.1.4 当液体冷却到55±2 ℃时，加入显色剂并混合均匀。

　　5.1.5 立即用无菌注射器吸取15 mL琼脂混合物液体，转移至灭菌玻璃瓶(6.1)中，并加盖密封，自然冷却后放在2~8 ℃环境下储存备用，储存有效期为6个月。

　　5.2 乙醇溶液

　　体积分数为75%的乙醇水溶液。

　　6 设备

　　6.1 玻璃瓶

　　无菌、透明、方形，带盖和密封条，容量约为60 mL。

　　6.2 注射器

　　无菌的一次性注射器，容量为1mL，最小刻度单位为0.01 mL。

　　6.3 环形分液器

　　无菌的一次性环形分液器，容量为0.01 mL。

　　6.4 移液器

　　带一次性吸头，容量分别为0.01 mL 、0.25 mL 、0.5 mL。

　　6.5 恒温箱

　　温度可控制范围为25±3 ℃且具备避光功能。

　　6.6 样品容器

　　无菌、透明，能够使抽取待检样品的设备插入至燃料表面以下约3cm的深度。若同时对燃料中水相进行检测，能够使抽取待检样品的设备接触样品底部沉积水。

　　7 取样

　　7.1 取样时应使用乙醇溶液清洗或擦拭取样阀和其他取样设备，取样前应确保乙醇挥发完全。从排放管路进行取样时，应在排放管路内存油放完后尽快取样，取油罐或过滤器中最先排出的燃油或含水燃油。

　　注：微生物含量检测结果受到燃料类型、取样位置、取样设备及其特定的操作环境影响。大多数微生物存在于罐底或油路系统的低点，尤其是在燃料与水的界面、燃料中游离水沉淀或悬浮的位置。

　　7.2 样品体积约为 1 L。

　　7.3 取样后，应在24 h 内进行微生物检测。

　　注：燃料样品中存在的微生物会慢慢死亡，待检时间越长，检测结果越不可靠。

　　7.4 如果样品采集 4h 后进行检测，应将样品储存在冰中或 5℃~10℃环境中保存。

　　注：样品储存温度太低也会使微生物死亡。

　　8 试验准备

　　8.1 培养基

　　使用前在避光环境下恒温至室温，移除盖封，备用。

　　8.2 恒温箱

　　控温至25±3 ℃。

　　9 试验步骤

　　9.1 外观检查

　　目测样品外观，并记录结果。若存在游离水，对样品中油相和水相进行检测。

　　9.2 样品油相采集

　　9.2.1 外观检查后，用力摇晃样品约 30 s，静置 12 ± 1 min 。若样品中的油相深度小于 6 cm 时，按每厘米油相液位静置2 min。

　　9.2.2 拧下玻璃瓶盖，将瓶盖放置在干净台面上，不应接触瓶盖或瓶颈的内部。

　　9.2.3 使用如注射器或移液器吸取样品油相表面以下约3 cm 深处的燃料，喷气燃料吸取样品量为0.5mL ，航空汽油吸取样品量为 0.25mL。

　　若燃料深度小于6 cm，在油相中间位置取样。取样时应避免吸取到样品中油水界面处可见的微粒、水滴或乳液。

　　9.2.3.1 注射器取样应从注射器手柄末端处打开无菌注射器包装，取出注射器，不应接触注射筒下端和注射器针头。吸取燃料直至超过样品量，将注射器针头向上，排出空气和多余燃料。

　　9.2.3.2 注射器和移液器配备的一次性吸头仅可使用一次。

　　9.2.4 将样品加入玻璃瓶中，立即拧紧瓶盖。并按照 9.4 和9.5 进行操作。

　　9.3 样品水相采集

　　9.3.1 完成样品油相微生物含量测定后，静置样品，直至水相沉降至样品底部。使用注射器或移液器吸取水相转移至另一个容器中，应避免抽取燃料。

　　9.3.2 油水分离后，立即反复翻转盛装水相的容器 3 次。

　　9.3.3 拧下玻璃瓶盖，将瓶盖放置在干净台面上，不应接触瓶盖或瓶颈内部。

　　9.3.4 使用环形分液器或移液器吸取 0.01mL 水样。

　　9.3.4.1 环形分液器取样应打开手柄末端处的金属箔消毒密封包装，再取出分液器，不应接触环形结构和下端。将环形结构浸入燃油中，再取出即可。

　　9.3.4.2 环形分液器和移液器配备的一次性吸头仅可使用一次。

　　9.3.5 将水样加入玻璃瓶后，立即拧紧瓶盖，并按照 9.4 和9.5 进行操作。

　　9.4 培养基处理

　　9.4.1 用手掌或橡皮塞或厚橡胶垫拍打玻璃瓶，使其中的凝胶培养基变松散。

　　9.4.2 用力摇晃玻璃瓶约 30 s ，使凝胶液化，并分散被检样品。摇晃均匀的凝胶应稍微粘稠，无块状物，透明度均匀。

　　注：凝胶中若存在气泡，不会影响试验结果。

　　9.4.3 快速震动玻璃瓶，使凝胶聚集在玻璃瓶底。

　　9.4.4 用手掌轻拍玻璃瓶，直至凝胶在玻璃瓶的其中一个最大面上形成厚度均匀凝胶层。

　　9.5 培育和检查

　　9.5.1 将玻璃瓶转移至避光环境或恒温箱中，在 25 ±3 ℃温度下，培育 4 天，不应倾斜玻璃瓶或扰动凝胶。

　　9.5.2 培育期间，每天观察一次。每次观察时，宜使用记号笔在玻璃瓶上标记红色或紫红色菌落，计数菌落数量，不应重复计数。培育期间和观察时，应避免扰动凝胶。

　　9.5.3 若因菌落数量太多而无法进行计数，则手持玻璃瓶，按照附录 A 的表A1 进行外观对比估计菌落数量，精确至十位数。

　　注：不同类型的微生物在凝胶培养基中生长速率不同，形成菌落的大小不同。有些细菌可活动， 在培育期形成不规则菌落，使凝胶呈现红色或紫色的条纹或斑点，每个条纹或斑点中心应计为一个菌落。燃料中的抗氧剂会干扰凝胶培养基中的微生物生长指示剂，使凝胶呈现均匀的浅桃色或橙色(通常在12 h内)。

　　9.6 灭菌处理

　　试验结束后，将样品容器、玻璃瓶等可重复使用的设备在121 ± 2 ℃温度下高压灭菌15 min，或放置在170±2 ℃的烘箱中灭菌1h，该灭菌时间不包括容器平衡至规定温度需要的时间。

　　使用高压灭菌法时，应确保容器在使用前为干燥状态。

　　10 计算

　　10.1 油相

　　使用下列公式(1)计算燃料中的微生物含量(CFU/L)：

　　微生物含量 (1)

　　式中：

　　C：菌落数量，CFU;

　　V：样品检测量，mL。

　　结果应保留至十位数。若使用建议的样品检测量，微生物含量应按表1进行保留。菌落数量超过100 CFU时，应在检测报告中说明。

　　表1 使用建议样品类型和检测量的试验报告

　　注：菌落数量超过100 CFU时，此结果已超过微生物含量定量分析的范围，结果的准确度和精确度可能较低

　　通过与附录A的表A1进行外观对比得出的菌落数量仅为半定量估算值，应在报告中注明。计算得出的燃料中的微生物含量(CFU/L)为近似值，结果保留应按科学记数法精确至十的乘方。

　　10.2 水相

　　使用下列公式(2)计算水相中的微生物含量(CFU/mL)：

　　微生物含量 = C (2)

　　V

　　式中：

　　C：菌落数量，CFU;

　　V：样品检测量，mL。

　　结果应保留至十位数。若使用建议的样品检测量，微生物含量应按表2进行保留。菌落数量超过100 CFU时，应在检测报告中说明。

　　表2 使用建议样品类型和检测量的试验报告

　　通过与附录A的表A1进行外观对比得出的菌落数量仅为半定量估算值，应在报告中注明。计算得出的水相中的微生物含量(CFU/mL)为近似值，结果保留应按科学记数法精确至十的乘方。

　　11 评级标准

　　11.1 油相

　　样品油相微生物污染等级应按表3进行评级。

　　表3 油相微生物污染等级

　　11.2 水相

　　样品水相微生物污染等级应按表4进行评级。

　　表4 水相微生物污染等级

　　12 报告

　　报告应至少包含以下内容：

　　a)参考标准;

　　b)样品类型;

　　c)取样位置;

　　d)取样时间和日期(若取样后超过24 h后进行的检测，应注明);

　　e)样品外观检查结果;

　　f)样品检测量;

　　g)恒温培育条件，包括培育温度、培育时间、指定范围以外的任何波动;注：培育时间是指从样品加入培养瓶的日期到最后一次观察的日期。

　　h)检测结果;

　　i)微生物污染等级。

　　附录 A

　　(规范性附录)

　　表 A1 菌落数量目测图表