中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5759—2024
克里米亚- 刚果出血热检疫技术规范
Quarantine protocol for Crimean Congo haemorrhagic fever
2024-12-16 发布2025-06-01 实施
ICS 11.220
CCS B 41
中华人民共和国海关总署发 布
I
前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
则起草。
本文件参照世界动物卫生组织（WOAH）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2022 版）3.1.5 章节
规定编写。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国大连海关、中华人民共和国南京海关、深圳市龙德生物科技
有限公司、中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国青岛海关、中国农业科学院特产研究所、中
华人民共和国沈阳海关、中华人民共和国上海海关、深圳技术大学。
本文件主要起草人：贾赟、万超、杨春光、宋慧君、姜焱、李健、贾鹏、李云峰、杨龙、王群、
龙云凤、徐超、张雪、刘钊、胡传伟、袁文泽。
1
克里米亚- 刚果出血热检疫技术规范
1 范围
本文件描述了克里米亚- 刚果出血热（CCHF）的实时荧光反转录聚合酶链式反应（Real Time
RT-PCR）和间接酶联免疫吸附试验（ELISA）诊断方法。
本文件适用于进出境动物中克里米亚- 刚果出血热的检疫。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489 实验室生物安全通用要求
SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则
3 术语、定义和缩略语
本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。
CCHF 克里米亚- 刚果出血热
CCHFV 克里米亚- 刚果出血热病毒
HRP 辣根过氧化物酶
Real Time RT-PCR 实时荧光反转录聚合酶链式反应
RNA 核糖核酸
dNTP 脱氧核苷三磷酸
4 CCHF 概述、病原学信息、流行病学信息及感染后的临床表现
详见附录A。
5 生物安全
实验室生物安全应符合GB 19489 的规定。按照SN/T 2984 的规定操作相应的实验材料，病毒分
离培养及动物感染实验必须在BSL-4 实验室内进行，未经培养的感染材料的操作在BSL-3 实验室内
进行，而灭活的材料的操作可在BSL-2 实验室内进行。
6 实时荧光反转录聚合酶链反应试验（Real Time RT-PCR）
6.1 仪器与耗材
6.1.1 荧光PCR 仪；
2
6.1.2 高速台式冷冻离心机（离心速度12 000 r/min 以上）；
6.1.3 台式离心机（离心速度2 000 r/min）；
6.1.4 混匀器；
6.1.5 冰箱（2℃～ 8℃和-20℃两种）；
6.1.6 微量可调移液器（10 μL、100 μL、1 000 μL）及配套无RNAse 污染吸头；
6.1.7 无RNAse 污染Eppendorf 管（1.5 mL）。
6.2 试剂
除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNAse 污染的容器（用DEPC
水处理后高压灭菌）分装。
6.2.1 裂解液：Tris 裂解液或其他等效裂解液；
6.2.2 氯仿；
6.2.3 异丙醇；
6.2.4 DEPC 水；
6.2.5 75% 乙醇；
6.2.6 PCR 反转录系统：AMV 反转录酶、一次性酶颗粒等其他等效RT-PCR 反转录系统；
6.2.7 dNTPs ：含有dATP、dUTP、dCTP、dGTP 各10 mmol/L ；
6.2.8 引物和探针：根据附录B 的序列，根据附录C.3 配制成储存液。
6.3 样品采集和处理
6.3.1 血液样品：血清、血浆或全血，用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf 管中，编号备用。
6.3.2 组织样品：取待检样品2.0 g 在研钵中充分研磨，加PBS 混匀，冻融两次，4℃，3 000 r/min
离心15 min，小心收取上清液备用。
6.4 样本总RNA 的提取
6.4.1 取n 个灭菌的1.5 mL Eppendorf 管，其中n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的总数。每管加
入600 μL 细胞裂解液，分别加入被检样品、阴性对照、阳性对照各200 μL，每加一份样品换用一
个吸头，再各加入200 μL 氯仿，在混匀器上振荡混匀5 s。于4℃、12 000 r/min 离心15 min。
6.4.2 取与6.4.1 相同数量灭菌的1.5 mL Eppendorf 管，加入500μL 异丙醇（-20℃预冷），做标记。吸
取6.4.1 各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL( 不能吸出中间层)，颠倒混匀。
6.4.3 于4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体( 不同样品
须在吸水纸不同地方沾干) ；加入600 μL 75% 乙醇，颠倒洗涤。
6.4.4 于4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同
样品须在吸水纸不同地方沾干）。
6.4.5 4 000 r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，
一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀的一面，室温干燥3 min，不能过于干燥，以免RNA 不溶。
6.4.6 加入10 μL DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2 000 r/min 离心5 s，冰上保存备用。
提取的RNA 须在2 h 内进行PCR 扩增；若需长期保存须放置-70 ℃冰箱。
注：也可直接采用同等效力的商品化RNA 提取（如磁珠法或膜法）试剂盒提取核酸。
6.5 实时荧光RT-PCR 扩增
6.5.1 扩增试剂准备
一步法实时荧光RT-PCR 反应体系见表1。各种试剂充分混合均匀，2 000 r/min 离心2 min, 向每个
3
荧光RT-PCR 管中各分装20 μL。
注：也可采用Ready-To-Go Beads 酶颗粒或商品化RT-PCR 一步法扩增试剂盒。
表1 荧光RT-PCR 反应体系
成分（浓度） 用量μL
2×Real Time RT-PCR 预混液12.5
上游引物（20 μmol/L） 1.0
下游引物（20 μmol/L） 1.0
探针SE01（5 μmol/L） 0.5
探针SE02（5 μmol/L） 0.5
探针SE03（5 μmol/L） 0.5
RNA 模板5.0
dd H2O 4.0
合计25
实时荧光RT-PCR 方法的引物与探针序列信息详见附录B。
6.5.2 加样
在各设定好体系的荧光RT-PCR 管中分别加入6.4 样本处理步骤中制备的阳性、阴性和样品RNA
各5 μL，盖紧管盖，1 000 r/min 离心30 s。
6.5.3 荧光RT-PCR 检测
将本标准6.5.2 中离心后的PCR 管放入荧光RT-PCR 检测仪内，记录样本摆放顺序。
循环条件设置：
第一阶段，反转录50oC、30 min ；
第二阶段，预变性95oC、10 min ；
第三阶段，95oC、10s，59oC、30s，46 个循环；
在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。实验检测结束后，根据收集的荧光曲线和CT 值判
定结果。
6.6 结果判定
6.6.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照
品扩增曲线的最高点为准。
6.6.1 质控标准
6.6.2.1 阴性对照：荧光通道无荧光信号检出，无相应的CT 值。
6.6.2.2 阳性对照：荧光通道有荧光信号检出，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的CT值＜30.0。
6.6.2.3 上述指标有一项不符合者，说明荧光RT-PCR 反应体系不正常，应重新进行实时荧光PCR 扩增。
4
6.6.3 结果描述及判定
在符合6.6.2 的情况下，可做出如下结果判定：
a）测试样品检测CT 值≤ 35.0，则判定为检测结果阳性，说明测试样品中含有CCHFV 核酸；扩
增靶标序列见附录B。
b）测试样品检测CT 值≥ 40.0，则判定为检测结果阴性，说明测试样品中没有CCHFV 核酸。
c）测试样品检测在35.0 ＜ CT 值＜ 40.0，应调整模板浓度，重新做实时荧光PCR。再次扩增后
CT 值＜ 40.0，则判定检测结果阳性；如再次扩增后CT 值≥ 40.0，则判定检测结果阴性。
7 酶联免疫吸附试验（间接ELISA）
注：本文件参照商品化试剂盒方法制定，可检测牛、羊是否感染过CCHF，体内是否含有CCHFV IgG 抗体。
7.1 主要试剂、材料与仪器
7.1.1 CCHFV 抗原包被板。
7.1.2 CCHFV 阳性对照血清、CCHFV 阴性对照血清。
7.1.3 辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。
7.1.4 样品稀释液、洗液、TMB 底物溶液、终止溶液的配制见附录C。
7.1.5 单孔道、多孔道可调微量移液器。
7.1.6 微孔板振荡器。
7.1.7 酶标仪。
7.1.8 恒温培养箱。
7.2 操作步骤
7.2.1 使用前，将试剂盒和样品放置常温下恢复到室温。在抗原包被板上，设置样品、阳性对照（2
复孔）、阴性对照（2 复孔）和空白对照（2 复孔）孔，并记录它们的位置。
7.2.2 将50 μL 阴性对照和50 μL 阳性对照分别加入设定孔中。将50μL 样品稀释液加入空白对照
孔作为空白对照。加样反复吹吸时，注意枪头不要碰到孔侧壁，将溶液添加到每个孔的底部，避免产
生气泡。
7.2.3 将50 μL 的稀释后的样品（稀释5 倍）加到样品孔中。轻轻拍打、摇匀混合或使用微孔板振
荡器。
7.2.4 封口膜封闭反应板，37℃孵育30 分钟。
7.2.5 弃上清液，每孔加300 μL 洗液（工作浓度）洗板。放置1 分钟后，在滤纸上倒扣微孔板拍打，
重复5 次。
7.2.6 向每孔（空白孔除外）加入50 μL 酶标二抗。用封口膜封闭微孔板，37℃孵育30 分钟。
7.2.7 弃上清液，按照7.2.5，重复5 次。
7.2.8 所有孔均加入50 μL TMB底物溶液，用封口膜封闭微孔板，轻轻摇匀。在37℃下避光孵育15分钟。
7.2.9 加50 μL 反应终止液。
7.2.10 在 450 nm 波长下，酶标仪测量结果读数。
7.3 结果判定
7.3.1 阳性对照的平均OD ≥ 1.00 ；阴性对照的平均OD ≤ 0.20。则试验有效，否则试验无效。
7.3.2 检测临界值的确定：临界（CUT OFF）值= 阴性对照+0.15。
7.3.3 结果判定：
样品OD< CUT OFF 值，判定样品为阴性，说明该动物未感染过CCHF，体内未有CCHFV 抗体；
样品OD ≥ CUT OFF 值，判定样品为阳性，说明该动物感染过CCHF，体内有CCHFV 抗体。
5
附 录 A
（资料性）
克里米亚- 刚果出血热概述、病原学信息、流行病学信息及感染后的临床表现
A.1 概述
克里米亚- 刚果出血热（Crimean-Congo hemorrhagic fever，CCHF）是由克里米亚- 刚果出血热
病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV）引起的一种严重的蜱媒人畜共患传染病。
A.2 病原学信息
CCHFV 属于布尼亚病毒科（Bunyaviridea）、内罗病毒属（Nairovirus），是分节段的负链 RNA 病
毒。与其他布尼亚病毒类似，病毒颗粒外观呈现球型，直径80 nm~100 nm，有 5 nm~7 nm 脂质双层
囊膜，囊膜上刺突蛋白长度为8 nm~10 nm。作为包膜病毒，在 55℃高温下 30 min 可灭活，也可以使
用福尔马林、次氯酸钠等消毒剂进行灭活。基因组包括 S、M、L 三个片段，S 片段长约为 1 672 nt，
负责编码病毒核蛋白（NP）。M 片段长约为5 366 nt。
A.3 流行病学信息
CCHF 疫情在非洲、亚洲、巴尔干半岛、中东、地中海等周边国家和地区均有过暴发。CCHFV
的自然宿主是蜱虫，作为全球分布最广泛的蜱传病毒，CCHF 疫情的流行与蜱虫的活动密切相关，呈
现明显的季节性和区域性，常发生在春季和夏季，4 月~6 月为疾病高发期。目前，已经在30 种蜱中
分离得到 CCHFV。CCHFV 的中间宿主有：骆驼、牛、马、羊等反刍兽，刺猬、野兔、鼠等小型啮齿
类哺乳动物，以及鸟类。大多数动物感染 CCHFV 后并不发病，病毒在其体内进行复制，导致病毒血
症。CCHFV 通过血液传播，宿主动物因此成为新的传染源。候鸟迁徙也可以传播 CCHFV。疫源地附
近的牧民、屠夫、医生（兽医）和护理人员是主要高危人群。
A.4 临床表现及危害
牛、羊等反刍动物，啮齿类动物，候鸟等脊椎动物均易感，且感染后无明显症状，CCHFV 可在
其体内复制，可导致病毒血症。CCHFV 是生物安全四级病原体，极具危害性，曾在我国新疆地区暴
发过疫情，对我国人民生命财产造成了严重的损失。人被感染主要经过蜱虫的叮咬，或直接接触被
CCHFV 感染的血液、体液、组织、器官及其他分泌物，患者的临床症状主要表现为高热、头痛、肌
肉痛、皮肤和粘膜出血、多器官功能衰竭等。
6
附 录 B
（资料性）
引物、探针和扩增特异性片段序列
B.1 克里米亚- 刚果出血热病毒实时荧光RT-PCR 方法引物、探针序列
引物与探针序列引自WOAH《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2022 版）3.1.5 章节荧光RT-PCR
方法内容，根据S 段基因设计，序列如下：
——上游引物 P1 ：5’-CAAGGGGTACCAAGAAAATGAAGAAGGC - 3’；
——下游引物 P2 ： 5’-GCCACAGGGATTGTTCCAAAGCAGAC - 3’；
——探针序列 SE01 ：5’-（FAM）ATCTACATGCACCCTGCTGTGTTGACA（TAMRA）- 3’
——探针序列 SE02 ：5’-（FAM）ATTTACATGCACCCTGCCGTGCTTACA（TAMRA）- 3’
——探针序列 SE03 ：5’-（FAM）AGCTTCTTCCCCCACTTCATTGGAGT（TAMRA）- 3’
B.2 扩增特异性片段序列（序列1）
AAGCAGCCAA GGGGGACCAA AAAAATGAAA AAGGCACTCC TGAGCACTCC AATGAAGTGG
GGGAAGAAGC TTTATGAGCT CTTTGCTGAT GACTCTTTCC AGCAGAACAG AATCTACATG
CACCCTGCTG TGTTGACAGC CGGTAGAATC AGTGAAATGG GTGTCTGCTT TGGAACAATC
CCTGTTGCCA
B.3 扩增特异性片段序列（序列2）
AAGCAGCCAA GAGGTACTAA GAAAATGAAG AAGGCTCTGC TGAGCACCCC AATGAAGTGG
GGAAAGAAAC TTTATGAACT CTTTGCCGAC GATTCTTTCC AGCAGAACAG GATCTACATG
CACCCTGCCG TGCTTACAGC TGGCAGAATC GGTGAAATGG GAGTCTGCTT TGGGACAATC
CCCGTGGCCA
7
附 录 C
（规范性）
试剂的配制
C.1 洗涤液（0.01 mol/L PBS-0.05% 吐温-20, pH7.4）（用于间接ELISA）
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2 g
磷酸氢二钠（NA2HPO4·12H2O） 2.9 g
氯化钠（NACl） 8.0 g
氯化钾（KCl） 0.2 g
吐温-20 0.5 mL
三蒸水加至 1 000 mL
现用现配。
C.2 血清稀释液（用于间接ELISA）
称取2.922 g NACl 置于100 mL 瓶中，加入约80 mL 的三蒸水，高温高压灭菌后冷却至室温，加
入4 mL 马血清，500 μL 吐温-80 ，用灭菌水补到100 mL，调节pH 值至7.2，4℃保存。
C.3 底物溶液( 用于间接ELISA)
C.3.1 0.1 mol/L 柠檬酸溶液
柠檬酸（C6H807） 1.92 g
加三蒸水至 100 mL
C.3.2 0.1 mol/L 磷酸氢二钠溶液
磷酸氢二钠（NA2HPO4·12H20) 3.58 g
加三蒸水至 100 mL
C.3.3 底物溶液（TMB-H2O2）
0.1 mol/L 柠檬酸溶液 33.0 mL
0.1 mol/L 磷酸氢二钠溶液 66.0 mL
四甲基联苯胺（TMB） 40.0 mg
30% 过氧化氢（H2O2） 1.5 mL
充分混合后装于褐色玻璃瓶避光存放。现用现配（亦可以用商品化试剂盒中提供的TMB 底物
溶液）。
C.4 终止液（用于间接ELISA）
1 mol/L 氢氟酸（HF）溶液。
