中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5758—2024
埃博拉出血热检疫技术规范
Quarantine protocol for Ebola haemorrhagic fever
2024-12-16 发布2025-06-01 实施
ICS 11.220
CCS B 41
中华人民共和国海关总署发 布
I
前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国南京海关、中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国上
海海关、中华人民共和国昆明海关、中华人民共和国南宁海关、中华人民共和国深圳海关、江西省科
学院生物资源研究所。
本文件主要起草人：龙云凤、祝贺、汪琳、李健、姜焱、杨春华、王群、贾赟、陆冠亚、赵晓
燕、陈晓芳、姜珊、胡珀、艾军、左天荣、秦智锋。
1
埃博拉出血热检疫技术规范
1 范围
本文件描述了埃博拉病毒的RT-PCR 和实时荧光RT-PCR 检测方法。
本文件适用于出入境动物埃博拉出血热的检疫。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088 出入境动物检疫采样
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Ct 值：阈值循环数（cycle-threshold value）
dNTPs ：脱氧核糖核苷酸（deoxynucleotide triphosphates）
DEPC ：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）
PCR ：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）
RNA ：核糖核酸（ribonucleic acid）
RT-PCR ：逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction）
Taq ：水生栖热菌（Thermus aquaticus）
实时荧光RT-PCR ：（real-time RT-PCR）
5 生物安全
埃博拉出血热是一种人兽共患病（见附录 A），实验室生物安全应符合 GB 19489 的规定。按照
SN/T 2984 的规定操作相应的试验材料，未经培养的感染材料的操作在BSL-3 生物安全实验室内进行，
灭活的材料和进出境检测样品可在BSL-2 生物安全实验室内操作。
2
6 仪器和设备
6.1 PCR 扩增仪。
6.2 荧光定量PCR 仪。
6.3 水平电泳仪。
6.4 凝胶成像仪。
6.5 普通冰箱和-80 ℃冰箱。
6.6 低温冷冻离心机（可控温至4 ℃，离心速度可达12 000 g 以上）。
6.7 二级生物安全柜。
6.8 高压灭菌锅。
6.9 微量可调移液器（2 μL，10 μL，100 μL，1 000 μL）及配套带滤芯吸头。
7 试剂和材料
在检测中使用的试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T 6682 的一级水的要求。
7.1 Trizol。
7.2 DEPC 处理水（见B.1）。
7.3 PBS ：0.1 mol/L（ 见 B.2）。
7.4 三氯甲烷。
7.5 异丙醇：使用前-20 ℃预冷。
7.6 75% 乙醇：用DEPC 水和无水乙醇配制，使用前-20 ℃预冷。
7.7 溴化乙锭（EB）：10 mg/mL，使用浓度为0.5 μg/mL。
7.8 Taq DNA 酶：-20 ℃保存。
7.9 dNTPs ：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各10 mmol/L 的混合物，-20 ℃保存。
7.10 AMV 逆转录酶：-20 ℃保存。
7.11 琼脂糖。
7.12 DNA Marker（100 bp~2 000 bp）。
7.13 TBE 电泳缓冲液（见B.3）。
7.14 上样缓冲液。
7.15 2× 荧光PCR 预混液。
8 检验程序
8.1 样品采集、保存及运输
样品的采集按照 GB/T 18088 执行。样品温度应保持在 0 ℃ 以下。样品的保存和运输的生物安全
要求参照《病原微生物实验室生物安全管理条例》的有关要求执行。
8.2 实验室检测
8.2.1 样品处理
组织样品先去除包膜和其他结缔组织，选取内部实质部分，置研钵中，加入石英砂充分研磨，
然后按照 1∶5 比例加入0.1 mol/L PBS（pH 7.6~pH 7.8），4 ℃浸泡过夜或者-20 ℃ 反复冻融2 次，每
次30 min，4 ℃ 条件下以8 000 g 离心5 min，取上清进行后续操作。
液体样品如血液、尿液、唾液不必经过研磨或冻融处理，直接进行后续操作。不能立即进行检测
3
时，样本冻存于-70 ℃左右超低温冰箱备用。
8.2.2 病毒核酸提取
8.2.2.1 Trizol 法
取灭菌的1.5 mL 离心管，做好标识。每管加入600 μL 裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、
阳性对照各200 μL，再加入200 μL 三氯甲烷，紧盖离心管，混匀器上振荡混匀15 s 后室温静置
5 min，于4 ℃ 12 000 g 离心15 min。取新的灭菌的1.5 mL 离心管，加入-20 ℃预冷400 μL 异丙
醇，吸取离心后将各管中的上清液转移至预冷的异丙醇中，避免吸出中间层，颠倒混匀。于4 ℃
12 000 g 离心15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，加入600 μL 75% 预冷乙醇，颠倒洗
涤。于4 ℃ 12 000 g 离心10 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，室温干燥5 min~10 min。
加入15 μL~20 μL DEPC 水，溶解管底的RNA，5 000 g 离心5 s，冰上保存备用，若长期保存应放
置在-70 ℃冰箱。
8.2.2.2 核酸提取等效方法
埃博拉病毒核酸提取也可以采用等效RNA 提取试剂及方法，如采用商品化试剂盒或自动化核酸
抽提仪和配套核酸抽提试剂进行核酸抽提。
8.2.3 阳性对照、阴性对照和空白对照
检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为根据埃博拉病毒核苷酸序列通
过基因合成、载体构建和体外转录合成的RNA，以及包含埃博拉病毒NP 或GP 基因的假病毒，阴性
对照可选择其他类病毒的核酸样本，空白对照为无菌水作为扩增模板。
8.2.4 RT-PCR 检测方法
8.2.4.1 检测引物
NP 基因扩增引物：
上游引物NP F ：5’ -GAGTATGCTCCTTTCGC-3’
下游引物NP R ：5’ -TTTGGTATTCGCCGTAG-3’
GP 基因扩增引物：
上游引物GP F ：5’ -GCAAGTGGGAAGAGGAG-3’
下游引物GP R ：5’ -CACGGGTGTATTATGGGT-3’
引物工作浓度均为10 μmol/L，配制后于-20 ℃左右保存。扩增目的基因片段长度分别为NP 基
因538 bp、GP 基因396 bp。
RT-PCR 扩增产物参考序列见附录C。
8.2.4.2 RNA 逆转录
在冰盒上配制20 μL 逆转录反应体系。在0.2 mL 离心管中依次加入：DEPC 处理水6.5 μL，随机
引物（25 μmol/L）2 μL，dNTPs（各10 mmol/L）1 μL，模板RNA（10 ng/μL~1 000 ng/μL）或空白对
照5 μL。混匀，短暂离心，65 ℃ 保温 5 min 后，冰上迅速冷却。然后在上述反应管中加入：5× 逆
转录酶缓冲液4 μL，RNA 酶抑制剂（40 U/μL）0.5 μL，AMV 逆转录酶（200 U/μL）1 μL。缓慢混匀。
按以下程序进行cDNA 合成：30 ℃ 10 min，42 ℃ 45 min ；95 ℃ 5 min 灭活逆转录酶，冰上冷却。合
成的cDNA 可立即用于PCR 扩增，或保存于-20 ℃备用。
可采用同等逆转录效率的商品化逆转录试剂盒。
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可采用同等逆转录效率的商品化一步法RT-PCR 试剂盒。
8.2.4.3 PCR 反应
在PCR 反应管中依次加入：去离子水33 μL，10×Taq DNA 聚合酶缓冲液（不含Mg2+）5 μL，
MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTPs（各10 mmol/L）1 μL，引物NP F 和NP R 或（GP F/GP R）各1 μL，
Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）1 μL，合成的cDNA 5 μL。混匀，置于PCR 仪中。按以下程序进行PCR 扩增：
95 ℃ 5 min ；（95 ℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min）35 个循环；72 ℃ 10 min。
8.2.4.4 琼脂糖凝胶电泳
用0.5×TBE 电泳缓冲液配制1.5% 的琼脂糖凝胶，加入适量的电泳核酸染料。分别取5 μL PCR
扩增产物与1 μL 6× 载样缓冲液混匀后加入样品孔，使用DL 2000 DNA 分子量标准物作为电泳参照。
置于水平电泳仪上5 V/cm 电泳，当载样缓冲液中溴酚蓝指示剂色带迁移至琼脂糖凝胶的2/3 处时停
止电泳，用凝胶成像仪观察扩增结果。
8.2.4.5 结果判定
用凝胶成像系统分析，NP 基因阳性对照扩增出一条大小为538 bp 的特异性条带，GP 基因阳性
对照扩增出一条大小为396 bp 的特异性条带，阴性对照和空白对照无特异性条带；在阴性对照和阳
性对照成立的情况下，如被检样品无条带，则结果为阴性，如被检样品有条带，且与阳性对照一致大
小，即判定为埃博拉病毒核酸阳性。
8.2.4.6 测序（可选择）
对于检测阳性的样本可切下电泳分析的目的条带，用凝胶回收试剂盒回收纯化（按其说明书进
行），进行测序确认病毒基因序列。
8.2.5 实时荧光RT-PCR 方法
8.2.5.1 引物和探针
用于检测NP 基因的引物和探针：
上游引物 NP-FQ ：5’-TTCCCTTTCCAGGACCCATC-3’
下游引物 NP-RQ ：5’-TCGGGAATGGTCGTATCCTG-3’
探针 NP-P ：5’-FAM-CCTGGCCATCAAGATGATGATCCGACT-BHQ1-3’
用于检测GP 基因的引物和探针：
上游引物 GP-FQ ：5’-AGCTGTATCAAACGGACCCA-3’
下游引物 GP-RQ ：5’-CTCGTGGAGATTGTGGCAAG-3’
探针 GP-P ：5’-FAM-CGCGCCGGACTCTGACCACT-BHQ1-3’
引物和探针的工作浓度均为10 μmol/L，配制后于-20 ℃左右保存。
实时荧光RT-PCR 扩增产物参考序列见附录D。
8.2.5.2 RNA 逆转录
见8.2.4.2
8.2.5.3 实时荧光PCR
采用20 μL 反应体系：荧光PCR 预混液（2×）10 μL，探针0.6 μL，上、下游引物各0.4 μL，
cDNA 模板1 μL，RNase free H2O 补足20 μL。反应程序：95 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性10 s，58 ℃
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30 s，40 个循环，每个循环结束时进行荧光信号的采集。检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct 值
判定结果。
8.2.5.4 结果判定及报告
本方法检验结果判定及报告如下。
——检测样本有明显的荧光增幅曲线，且Ct 值≤ 35 时，判为阳性，报告“检出埃博拉病毒核酸
（实时荧光RT-PCR 法）”。
——检测样本荧光增幅曲线的Ct 值介于35 和40 之间时，应重复进行试验，若重新检测的Ct 值
仍介于35 和40 之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告“检出埃博拉病毒核酸（实时荧
光RT-PCR 法）”；否则判为阴性，报告“未检出埃博拉病毒核酸（实时荧光RT-PCR 法）”。
——检测样本荧光增幅曲线的Ct 值介于40 和45 之间时，可采用膜过滤法浓缩核酸样本，再重
新进行实时荧光RT-PCR 检测。若重新检测的Ct 值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数增长期，
判为阳性，报告“检出埃博拉病毒核酸（实时荧光RT-PCR 法）”。此类样本建议采用其他方法进一
步验证；否则判为阴性，报告“未检出埃博拉病毒核酸（实时荧光RT-PCR 法）”。
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附 录 A
（资料性）
埃博拉出血热
A.1 概述
埃博拉出血热（Ebola haemorrhagic fever，EHF）是一种人兽共患病，是由丝状病毒科的埃博拉病
毒（Ebola virus，EBOV）导致人和非人灵长类动物( 如猩猩和猴子) 发生急性感染的烈性出血性传染
病，人感染后死亡率高达50 %~90 %。
A.2 传染源及宿主动物
埃博拉出血热的暴发存在多个发源地，可能有多个寄主。一般认为，狐蝠科的果蝠（fruti
bat），尤其是活跃在撒哈拉以南的非洲（包括几内亚）的 3 类水果蝙蝠——无尾肩章果蝠（Epomops
franqueti）、锤头果蝠（Hypsignathus monstrosus）和小领果蝠（Myonycteris torquata）被认为是埃博拉
病毒可能的自然宿主。受病毒感染的果蝠通过直接或间接的方式与其他动物接触来散播病毒，导致人
类和非人灵长类动物如大猩猩、黑猩猩、恒河猴、猕猴的大规模流行。有研究发现在中非仓鼠和尖鼠
体内检测到埃博拉病毒核酸，标志着啮齿类动物也有可能是储存宿主。另外，猪和犬是至今为止确定
能感染埃博拉病毒的家畜。此外，有报道来自非洲热带丛林中的森林羚羊和豪猪感染埃博拉出血热情
况。潜在媒介调查中，在节肢动物包括臭虫、半翅类昆虫等体内未检测发现有埃博拉病毒。
A.3 临床症状
早期症状为起病急，突然高热、极度乏力、剧烈头痛、咽喉痛，全身肌肉和关节疼痛，可能
还有寒颤和精神萎靡等。随后可出现严重的腹内疼痛、恶心、吐逆和泻肚等消化系统病状。发病
4 d~5 d 后进入极期，患者主要表现为持续高烧，全身感染中毒症候和消化道病症更加严重，并伴有
不同水平的出血现象，包含口鼻、结膜、肠胃、阴道和肌肤等部位出血，也见呕血和血尿等，多数患
者可在面、颈、躯干和手臂等部位出现弥漫性红斑样丘疹，这是区别于其他类似疾病的症状。特重者
可出现意识窒碍（如谵妄、嗜睡）、休克、多器官衰竭及致死性并发症等。
A.4 病理变化
埃博拉出血热的主要病理变化是皮肤、黏膜和脏器的出血，且多个内脏器官可见局灶性坏死，
但以肝脏和淋巴组织最为明显和严重。肝细胞呈现点状和灶状坏死是埃博拉出血热的典型特征，可见
多个凋亡小体和小包涵体。同时在淋巴结和脾脏中可见广泛的淋巴细胞耗竭、坏死和凋亡。尸检时，
会发现患者器官呈“液化”现象。
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附 录 B
（规范性）
试验试剂配制
B.1 DEPC 水
每升去离子水中加入1 mL DPEC，用力摇匀，使DEPC 充分混匀在水中，37 ℃ 放置12 h 以上，
再经121 ℃ 15 min 高压灭菌备用。
B.2 0.01 mol/L PBS（pH 7.6~pH 7.8）
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 3.0 g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2 g
氯化钾（KCl） 0.2 g
氯化钠（NaCl） 8 g
加去离子水定容至1 000 mL，完全溶解后用3 mol/L 的NaOH 调pH 为7.6~7.8。经121 ℃，15 min
高压灭菌，室温保存。
B.3 电泳缓冲液
B.3.1 成分(10×TBE)
Tris 碱 108 g
Na2EDTA·H2O 7.44 g
硼酸 55 g
加去离子800 mL，充分搅拌完全溶解后定容至1 000 mL，室温保存。
B.3.2 0.5×TBE 配制
量取50 mL 10×TBE 电泳缓冲液，加灭菌双蒸水至1 000 mL，充分混匀。
8
附 录 Ｃ
（资料性）
RT-PCR 扩增产物参考序列
GP 基因：396 bp
GCAAGTGGGAAGAGGAGCAACACCACGGGAAAACTAATTTGGAAGGTCAACCCCGAAATTGAT
ACAACAATCGGGGAGTGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAAAAATTCGCAG
TGAAGAGTTGTCTTTCACAGCTGTATCAAACGGACCCAAAAACATCAGTGGTCAGAGTCCGGCG
CGAACTTCTTCCGACCCAGAGACCAACACAACAAATGAAGACCACAAAATCATGGCTTCAGAA
AATTCCTCTGCAATGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACA
ACCCTTGCCACAATCTCCACGAGTCCTCAACCTCCCACAACCAAAACAGGTCCGGACAACAGC
ACCCATAATACACCCGTG
注：波浪线区域为基因序列高度可变区。
NP 基因：538 bp
GAGTATGCTCCTTTCGCCCGACTTTTGAACCTTTCTGGAGTAAATAATCTTGAGCATGGTCTTTTC
CCTCAACTGTCGGCAATTGCACTCGGAGTCGCCACAGCCCACGGGAGCACCCTCGCAGGAGTA
AATGTTGGAGAACAGTATCAACAGCTCAGAGAGGCAGCCACTGAGGCTGAGAAGCAACTCCAA
CAATATGCGGAGTCTCGTGAACTTGACCATCTTGGACTTGATGATCAGGAAAAGAAAATTCTTAT
GAACTTCCATCAGAAAAAGAACGAAATCAGCTTCCAGCAAACAAACGCGATGGTAACTCTAAG
AAAAGAGCGCCTGGCCAAGCTGACAGAAGCTATCACTGCTGCATCACTGCCCAAAACAAGTGG
ACATTACGATGATGATGACGACATTCCCTTTCCAGGACCCATCAATGATGACGACAATCCTGGCC
ATCAAGATGATGATCCGACTGACTCACAGGATACGACCATTCCCGATGTGGTAGTTGACCCCGAT
GATGGAGGCTACGGCGAATACCAAA
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附 录 D
（资料性）
实时荧光RT-PCR 扩增产物参考序列
GP 基因：195 bp
AGCTGTATCAAACGGACCCAAAAACATCAGTGGTCAGAGTCCGGCGCGAACTTCTTCCGACCCAGAGAC
CAACACAACAAATGAAGACCACAAAATCATGGCTTCAGAAAATTCCTCTGCAATGGTTCAAGTGCACAG
TCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCACGAG
NP 基因：88 bp
TTCCCTTTCCAGGACCCATCAATGATGACGACAATCCTGGCCATCAAGATGATGATCCGACTGACTCACA
GGATACGACCATTCCCGA
