T/CSF 0147-2026 联邦121制剂质量控制及其林间防治松材线虫病技术规程

　　CSF

　　团 体 标 准

　　T/CSF 0147—2026

　　联邦 121 制剂质量控制及其林间防治

　　松材线虫病技术规程

　　Technical specification for quality control of Federal 121 preparation and

　　its field application against pine wilt disease

　　2026-03-19 发布 2026-03-19 实施

　　中国林学会 发 布

　　前 言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所提出。

　　本文件由中国林学会归口。

　　本文件起草单位：中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所、国家林业和草原局生物灾害防控中心、江苏擎宇化工科技有限公司、浙江省林业科学研究院、浙江启潮生物科技有限公司、临沂大学、广西新方向现代农业发展有限公司、浙江省森林病虫害防治总站、湖南省常德市林业局桃花源分局、泰安市泰山森林病虫害防治检疫站、烟台昆嵛山国家级自然保护区自然资源和科研宣教服务中心、重庆森科生物技术(集团)有限公司、湖北省林业科学研究院、靛石(北京)生物科技研究有限公司、湖北山青水绿生态科技有限公司、歙县林业局、江西梁希林业有限公司、宜春市袁州区林业局、广西大学、广西壮族自治区林业有害生物防治检疫站、青岛森昌源园林工程有限公司、安徽省林业科学研究院、河南省林业科学研究院、国家林业和草原局竹子研究开发中心、中国林业科学研究院热带林业研究所。

　　本文件主要起草人：理永霞、温晓健、方国飞、刘振凯、王璇、张伟、李东振、冯宇倩、张星耀、曹雄飞、朱汤军、司文、王振、霍洁、章滨森、洪学智、申卫星、郭晓蕾、张雷、洪承昊、孙玉娟、张继锋、程庆明、韩永、刘桃生、胡平、刘杰恩、于少杰、李晓娟、杨海青、章彦君、马海宾。

　　联邦 121 制剂质量控制及其林间防治松材线虫病技术规程

　　1 范围

　　本文件规定了联邦 121 制剂质量控制及其林间防治松材线虫病的制剂质量要求、运输与储存、林间应用技术和安全注意事项等内容。

　　本文件适用于松材线虫病的无人机喷雾防治。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 25415 航空施用农药操作准则

　　GB/T 43071 植保无人飞机

　　LY/T 2024 轻型直升机喷洒防治林业有害生物技术规程

　　NY/T 1276 农药安全使用规范 总则

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　联邦 121 制剂 Federal 121 preparation

　　一种松材线虫病的预防性制剂，由松材线虫寄生性真菌线虫埃斯特菌(Esteya vermicola)Fxy121菌株(原 Fxy120 菌株)、疫木源小分子疫苗和助剂组成，包括水剂和可湿性粉剂。

　　3.2

　　线虫埃斯特菌 Esteya vermicola

　　一种松材线虫寄生性真菌，在分类上属于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，蛇口壳目(Ophiostomatales)，埃斯特菌属(Esteya)，线虫埃斯特菌(Esteya vermicola)。

　　3.3

　　线虫埃斯特菌水剂 Esteya vermicola aqueous solution

　　由线虫埃斯特菌 Fxy121 菌株(原 Fxy120 菌株)经生物发酵生产与加工获得的芽生孢子或分生孢子悬浮液。

　　3.4

　　线虫埃斯特菌可湿性粉剂 Esteya vermicola wettable powder

　　由线虫埃斯特菌 Fxy121 菌株(原 Fxy120 菌株)经生物发酵生产与加工而获得的芽生孢子或分生孢子可湿性粉剂。

　　3.5

　　疫木源小分子疫苗 infected wood-derived small molecule vaccine

　　由松材线虫当年侵染致死的松树木段，经高温蒸馏、萃取等制成，主要成分为有机酸和酚类。

　　3.6

　　助剂 adjuvant

　　主要成分为聚醚改性三硅氧烷类表面活性剂和甲酯化植物油，能够增强药液润湿性，提高药液附着性。

　　4 制剂质量要求

　　4.1 线虫埃斯特菌制剂含孢量

　　每毫升线虫埃斯特菌水剂中含有≥1×109 个孢子。每克线虫埃斯特菌可湿性粉剂中含有≥1×108 个孢子。线虫埃斯特菌鉴定特征见附录 A ，水剂和可湿性粉剂含孢量测定方法见附录 B。

　　4.2 疫木源小分子疫苗质量指标

　　疫木源小分子疫苗外观为澄清透明的黄褐色液体，pH 值为 2.3～2.5，有机酸质量分数为2.5%～5.5%，总酚含量为 15 g/L～25 g/L 。疫木源小分子疫苗质量测定方法见附录 C。

　　4.3 助剂质量控制指标

　　助剂外观为浅黄色透明可流动液体，在水中可以任意比乳化，pH 值为5.0～8.0。

　　4.4 贮存稳定性

　　线虫埃斯特菌水剂和可湿性粉剂均应密封保存，在 4℃~10℃条件下存放 180 d，孢子萌发率大于75%。疫木源小分子疫苗和助剂在室温条件下存放 1 a 外观保持不变。

　　5 运输与储存

　　5.1 联邦 121 制剂在运输过程中应采取密封包装，并注意防潮、防晒、防雨淋、防高温。

　　5.2 线虫埃斯特菌水剂出厂后应采用冷藏(4℃~10℃)条件运输，并于冷藏(4℃~10℃) 条件下储存;线虫埃斯特菌可湿性粉剂应在 25℃以下运输，并于冷藏(4℃~10℃) 条件下储存;疫木源小分子疫苗和助剂应在室温条件下运输及储存。运输与储存记录表见附录 D。

　　6 林间应用技术

　　6.1 防治区管理

　　6.1.1 防治区确定原则

　　适用于松材线虫病发生较轻的林地(林地受松材线虫侵染致死的枯死松树数量≤2 株/hm2)或松材

　　线虫病未发生的林地。

　　6.1.2 防治区环境要求

　　防治区及周边 10 m 范围内应无影响安全飞行的高压线塔、电线及电线杆等障碍物，作业前应清理防治区内枯死松树。

　　6.1.3 作业公告

　　施药作业前 3 d，向社会公告作业时间、作业区域、喷雾机型、喷施药剂与种类、安全注意事项等，在作业区域设置明显的警示牌或警戒线。

　　6.2 气象条件

　　6.2.1 最适作业温度为20℃~30℃,相对湿度30%～90%，能见度>2 km。一般选在早上(6:00～10:00)或下午(16:00～19:00)作业。气温超过 35℃或风速超过4 m/s(3 级风)时，停止作业。

　　6.2.2 喷药作业后 12 h 内，如出现一次性降雨达到中雨及以上(降雨量≥10 mm)，应重新喷药。

　　6.3 作业适期

　　在当地媒介昆虫羽化前 15 d～30 d 为无人机喷雾防治的作业适期，不同地区联邦 121 制剂作业时间见附录 E。

　　6.4 飞防作业

　　6.4.1 药液配制

　　线虫埃斯特菌水剂用量为 15L/hm2 ，稀释 1 倍后施用;可湿性粉剂用量 1.5 kg/hm2 ，每公顷兑水至30 L;小分子疫苗添加量为稀释后菌液的 0. 1%，即每公顷添加 30 mL;助剂添加量为稀释后菌液的 1%，即每公顷添加 300 mL;在飞防现场将菌液与小分子疫苗和助剂混匀后装机。配制好的药液在2 h 内使用完毕。

　　6.4.2 喷雾作业

　　6.4.2.1 根据作业区域地形或地势调整作业参数，每次施药时飞行作业高度离树冠上方 5 m～10 m，确保菌液落到树冠，每条喷幅的两侧应有一定的重叠，避免出现漏防现象。具体喷雾操作按照 GB/T 25415执行。

　　6.4.2.2 选用配有离心喷头的无人机进行作业，最大作业飞行速度控制在 5 m/s～6 m/s，雾滴最佳粒径为 150 μm～300 μm 。无人机安全操作要求按照 GB/T 43071 执行。

　　6.4.3 飞防作业质量测定

　　用喷洒量、有效喷幅宽度、雾滴大小、雾滴覆盖密度、雾滴分布均匀度和回收率表示作业质量，具体测定方法按照 LY/T 2024 执行。

　　6.5 防治效果评价

　　6.5.1 对照区设置

　　防治前，在防治区附近选择≥2 hm2 的林地作为空白对照区，对照区应与防治区林分组成相同，且林龄、发病程度相近，对照区与防治区中间应有 10 m 以上的隔离带，对照区不进行喷洒作业，也不采

　　取其它方式进行防治，只清理枯死松树。

　　6.5.2 调查时间

　　防治前一年 11 月份和防治当年 11 月份，各调查 1 次林间枯死松树数量。联邦 121 制剂防治效果调查记录表见附录 F。

　　6.5.3 评价方法

　　利用无人机采集防治区和对照区林地正射影像，利用 ArcGIS 软件将航拍照片与林地小班图叠加，制作枯死松树小班分布图，采用人工判读的方式标注林地内枯死松树。以校正枯死松树减退率作为防治效果的评价指标，计算方法见公式(1)和(2)。

　　枯死松树减退率按公式(1)计算：

　　Rd00% …………………………(1)

　　Rd ——枯死松树减退率;

　　Nb ——前一年累计枯死松树数量，单位为棵;

　　Na ——当年累计枯死松树数量，单位为棵。

　　校正枯死松树减退率按公式(2)计算：

　　Rc00% …………………………(2)

　　Rc ——校正枯死松树减退率;

　　Rd,t ——防治区枯死松树减退率;

　　Rd,c ——对照区枯死松树减退率。

　　7 安全注意事项

　　飞行防治作业参与人员应具有专业资格证书，并按照 NY/T 1276 的规定做好安全防护。

　　附 录 A

　　(资料性)

　　线虫埃斯特菌的鉴定特征

　　A.1 线虫埃斯特菌的形态鉴定特征

　　在PDA固体培养基上25℃黑暗培养1 d 后，产生白色菌丝。第3 d 分泌墨绿色色素，菌株背面由绿色变为墨绿色，呈绒毛状，菌落边缘光滑。在PDA固体培养基上会产生两种分生孢子，其中，1型分生孢子透明，杆状，不具有粘附性;2型分生孢子梗单生，直立，基部安瓿瓶形，向顶端渐细，整体弯曲。分生孢子单生，透明，半月形或椭圆形，向内凹陷，末端稍尖，具粘性。液体生物发酵后，会产生大量圆形、卵形或长椭圆形的芽生孢子，芽生孢子萌发形成菌丝，菌丝特化形成安瓿瓶形产孢细胞，产生新月形粘性孢子;固体生物发酵与PDA固体培养形态相似。

　　图A.1 给出了线虫埃斯特菌株Fxy121(原Fxy120)在PDA培养基25℃培养5d的菌落形态及分生孢子形态。

　　图A.1 线虫埃斯特菌株Fxy121(原Fxy120)菌落形态及分生孢子形态图注：a：菌落正面;b：菌落反面;c：分生孢子形态;d：分生孢子梗。

　　A.2 线虫埃斯特菌的分子鉴定特征

　　通过提取试样真菌DNA作为模板，使用线虫埃斯特菌的特异性引物进行PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳检测后，若检测出片段大小为522 bp的单一条带，则试样为线虫埃斯特菌。所述特异性引物序列为：

　　——上游引物：5’-TCCCTTCTCTCTCTCTGCCC-3’，

　　——下游引物：5’-GATTGGCGTTGATGGGGTTG-3’。

　　线虫埃斯特菌株Fxy121(原Fxy120)特异性基因片段序列(含引物序列，522 bp)如下：

　　TCCCTTCTCTCTCTCTGCCCACTCCCGCCCTCCAGGCATATTCGTCGGGCACGGCGTCGCCGC GGGTCAGCTCCATTGCCTCCTCCACGAGCTCCAACGCCGACTCCCAGTCCTCCTACACCTCGGCC GCCTCGTCCAACGGACCCAAGACACCCCCGTCGTCCCTTGCCGGCTCCGGCGTCCACCCCGGCGT CCACTCTGGCTCGCTCCTCCCCAGCTCCTTACATACCCCCCTCACACAGCCACCACACATTACCGG CTACGAGCAATACCAACAAGCTATGAATCAAGGAGCTGCAGACATGTACTACCAGCAGTCACAC ATGCCTGGCGGTCAGGGCCCTCCGCCGCCCCCCGTCACGTCTGGTGCCCTCACTCAATACAACCC GCACCAGCCCCCGCTGCTGCCGCCCGGCCCGGCCCAGTACACTAACCCCTCGCCCTACGGCCAGT ACGGCTACCCGAGCGGCCTCACCTCTCCTCCCACCGGGCCCCCCGTGTCCAACCCCATCAACGCC AATC

　　附 录 B

　　(资料性)

　　线虫埃斯特菌水剂和可湿性粉剂含孢量测定方法

　　B.1 线虫埃斯特菌水剂

　　将1 mL水剂稀释至适当倍数，在显微镜下用血球计数板计孢子数量，然后计算含孢量，每毫升孢子悬浮液含有≥1×109个孢子为合格，具体计算方法如下。

　　取深度为0.1mm、血球计数板格为25×16个中格，盖上配套专用盖玻片，用吸管吸取配制好的悬浮液沿盖玻片边缘滴入，使孢子液恰好充满盖玻片于载玻片之间，以孢子液不入槽为度，多余孢子液用滤纸吸去。放在显微镜载物台上静置1min～2 min，待浮动的孢子静止后，放大400 倍检视计数。将孢子浓度控制在每中格20个～40个进行计数。

　　血球计数板计数格为25个中格，每个中格为16个小格，计算双线范围内任一斜对角线上的4个中格和中间的中格共80个小格的孢子总数。计数时每中格的四周如有压线的孢子，计上线不计下线，计左线不计右线。按公式(B. 1)计算待测样品的孢子含量：

　　s04×T …………………………(B.1)

　　式中：

　　S ——含孢量，单位为个每毫升(个/mL);

　　S1-S5 ——5个中格里孢子的数量，单位为个;

　　T ——稀释倍数。

　　每个样品设3个重复，允许误差率为10%。

　　B.2 线虫埃斯特菌可湿性粉剂

　　用精度为千分之一的天平准确称取粉剂1 g，加入0.1 mL的吐温80和100 mL无菌水搅拌溶解，使之成为均匀的孢子悬浮液。将孢子浓度控制在每中格20个～40个进行计数。如果不合适可以稀释样品调节浓度。技术方法参照B.1 。每克线虫埃斯特菌可湿性粉剂中含有≥1×108个孢子为合格。

　　附 录 C

　　(资料性)

　　疫木源小分子疫苗质量测定方法

　　C.1 pH的测定

　　利用pH计测定疫木源小分子疫苗的pH ，pH值在2.3～2.5的范围内为合格。

　　首先确保pH计已经校准，检查电极是否干净，如有必要，用蒸馏水清洗电极。将电极浸入待测溶液中，确保电极的敏感部分完全浸没。轻轻搅拌溶液或等待读数稳定，记录pH值。测量完成后，取出电极并用蒸馏水清洗。

　　C.2 有机酸含量的测定

　　C.2.1 氢氧化钠标准溶液的配制与标定

　　通过酸碱滴定法对疫木源小分子疫苗的有机酸含量进行测定，有机酸质量分数为2.5%～5.5%为合格。

　　称取4g 氢氧化钠，溶于无CO2水中，并稀释至1 L。以邻苯二甲酸氢钾标定其浓度。

　　方法是：准确称取3份干燥过的邻苯二甲酸氢钾0.25 g～0.30 g，分别置于250 mL三角瓶中，用80 mL无CO2水溶解，加酚酞指示剂2滴～3滴，用所配氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，同时做空白试验。依公式(C. 1)计算氢氧化钠的准确浓度，求3份样品的平均值，结果保留至小数点后4位。

　　c …………………………(C.1)

　　式中：

　　c(NaOH)——氢氧化钠标准溶液的浓度，单位摩尔每升(mol/L);

　　m ——邻苯二甲酸氢钾的质量，单位为克(g);

　　V1 ——氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升(mL);

　　V2 ——空白试验氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升(mL);

　　0.2042 ——与1.00 mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.0000mol/L]相当的以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。

　　C.2.2 样品测定与计算

　　取小分子疫苗1mL，稀释10倍，取2 mL稀释液置于50 mL三角瓶中，滴入2滴酚酞指示剂，用标定的氢氧化钠滴定至粉红色不褪为止，记录氢氧化钠的用量，根据式(C.2)计算有机酸质量分数。

　　X00% …………………………(C.2)式中：

　　X ——样品中有机酸的质量分数，单位为%;

　　c(NaOH)——氢氧化钠标准溶液的浓度，单位摩尔每升(mol/L);

　　V ——滴定消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL);

　　60 ——乙酸的摩尔质量，作为有机酸的平均摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol);

　　10 ——稀释倍数，单位为毫升(mL);

　　1 ——初始取样体积，单位为毫升(mL);

　　2 ——所取稀释液的体积，单位为毫升(mL);

　　1000 ——换算系数，将mL转换为L。

　　C.3 总酚含量

　　C.3.1 标准曲线的绘制

　　采用福林酚法测定疫木源小分子疫苗中总酚含量，总酚含量为15 g/L～25 g/L为合格。

　　准确称取0.1g没食子酸，用50 mL蒸馏水溶解、定容至100 mL，得到质量浓度为1000 mg/L的没食子酸标准溶液。分别取标准溶液0 、1.25mL、2.5mL 、5mL、10mL、20mL和40 mL于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，配制成质量浓度为0、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L 、100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L的系列标准溶液。

　　取1 mL标准液于15 mL的试管中，分别加入1 mL福林酚显色剂及3 mL 20%碳酸钠溶液，混匀，于50℃水浴反应30 min。在765 nm波长下测定吸光度。每个浓度做3个平行试验，取平均值，绘制标准曲线，得到吸光值A与没食子酸标准溶液浓度(c ，mg/mL)之间的回归方程。

　　C.3.2 样品测定与计算

　　取1 mL小分子疫苗，按C.3. 1的步骤加入福林酚试剂和碳酸钠溶液，反应后测定吸光度。将测得的吸光值代入回归方程，计算样品中的总酚含量，结果以mg/mL表示。

　　附 录 D

　　(规范性)

　　联邦 121 制剂运输与储存记录表

　　表D.1给出了联邦121制剂运输与储存记录表格式。

　　表D.1 联邦121制剂运输与储存记录表

　　附 录 E

　　(资料性)

　　松材线虫病疫区媒介昆虫羽化时间和联邦 121 制剂作业时间

　　表E.1给出了松材线虫病不同地区媒介昆虫羽化时间和联邦121制剂作业时间表。

　　表E.1 松材线虫病疫区媒介昆虫羽化时间和联邦121制剂作业时间

　　注：不同地区媒介昆虫羽化时间存在明显差异，以当地媒介昆虫羽化前 15 d～30 d 为联邦 121 作业时间。

　　附 录 F

　　(规范性)

　　联邦 121 制剂防治效果调查记录表

　　表F.1给出了联邦121制剂防治效果调查记录表格式。

　　表F.1 联邦121制剂防治效果调查记录表

　　_________________________________