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GXAS
团 体 标 准
T/GXAS 883—2024
马尾松组培苗松材线虫病抗性室内鉴定
技术规程
Technical code of practice for indoor identification of resistance to pine wilt disease in tissue culture seedlings of Pinus massoniana
2024 - 12 - 03 发布 2024 - 12 - 09 实施
广西标准化协会 发 布
前 言
本文件参照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由广西林学会提出、宣贯并归口。
本文件起草单位：广西壮族自治区林业科学研究院、广西壮族自治区林业有害生物防治检疫站、龙岩市林业种苗站、中国林业科学研究院热带林业实验中心。
本文件主要起草人：王胤、姚瑞玲、黄华艳、洪永辉、钟雅婷、于松毛、罗辑、莫如江、李枷霖、杨秀好、谌红辉、潘文、刘海龙、武建云。
引 言
本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到4.7、5.1、5.3、5.4与马尾松组培苗松材线虫病抗性室内鉴定技术相关的专利的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性，有效性和范围无任何立场。
该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：
专利持有人姓名：王胤、姚瑞玲、黄华艳、钟雅婷。
地址：广西壮族自治区南宁市西乡塘区邕武路23号。
请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
马尾松组培苗松材线虫病抗性室内鉴定
技术规程
1 范围
本文件界定了马尾松(Pinus massoniana Lamb.)组培苗松材线虫( Bursaphelenchus xylophilus)病抗性室内鉴定与评价涉及的术语和定义，规定了松材线虫病抗性室内鉴定与评价技术中接种体制备、室内抗性鉴定、抗性评价等阶段的操作指示,描述了鉴定过程信息的追溯方法。
本文件适用于室内环境下对马尾松组培苗松材线虫病抗性的鉴定与评价。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 23476 松材线虫病检疫技术规程
GB/T 23477 松材线虫病疫木处理技术规范
GB/T 35342 松材线虫分子检测鉴定技术规程
DB 45/T 1709 马尾松组培快繁技术规程
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
松材线虫病 pine wilt disease caused by pine wood nematode
由松材线虫寄生在松树体内引起松树迅速死亡的一种毁灭性林木病害。又称松树萎蔫病、松材线虫萎蔫病、松树枯萎病。
[来源：GB/T 23476，3.1]
3.2
混合群体 mixed strain
来源于3个以上松材线虫病生态分布区域的致病性松材线虫混合在一起的群体。
3.3
分离群体 segregation population
从同一疫区同一病疫木中利用线虫分离法收集到的松材线虫群体。
3.4
室内鉴定 indoor appraisal
在人工控制温度、湿度及光照条件的环境下，检验测定马尾松组培苗在人工接种松材线虫混合群体后的抗性水平。
3. 5
抗性评价 evaluation of disease resistance
根据接种松材线虫混合群体后马尾松组培苗的发病程度进行抗性判定与评估。
4 接种体制备
4.1 线虫分离
线虫分离方法如下：
a) 在病害发生地选取由松材线虫致死的当年马尾松枯死植株，在树干上取 25 cm～30 cm 的木段用于松材线虫取样;
b) 选取木段中部的木块 100 g～200 g，用自来水洗净，切碎;
c) 按照 GB/T 23476 中的贝尔曼漏斗法分离线虫，并使用指形管收集各分离群体;
d) 不同疫区的松材线虫群体按照“地理来源—年份—序列号”进行编号。
4.2 线虫鉴定
将分离群体的松材线虫按照GB/T 23476的规定进行形态鉴定和分子生物学鉴定。
4.3 线虫纯化
在40×体式显微镜下，用接种针挑取线虫的5龄雌虫、雄虫放到培养皿中备用。
4.4 线虫消毒
将纯化后的松材线虫放在0.1%硫酸链霉素溶液中消毒5 min，用灭菌水洗3次。
4.5 线虫培养
在超净工作台上，将消毒后的松材线虫接种到灰葡萄霉菌丝生长良好的PDA平板培养基上，置于25 ℃下恒温培养箱中培养7 d～10 d。
4.6 线虫保存
将培养后的线虫置于4 ℃条件下保存。
4.7 线虫筛选
筛选方法如下：
a) 以 1 年生以上黑松实生苗( Pinus thunbergii Parl.)为接种对象;
b) 在自然条件下的苗圃、大棚，以及人工控制环境(温度 30 ℃~35 ℃, 空气湿度 60%～70%,光照强度 8 000 1x～12 000 1x)的培养室内，分别同时进行线虫接种测试;
c) 每种环境设 2 个试验区，共 6 个试验区，每个分离群体松材线虫在各试验区内接种 30 株;
d) 接种后 30 d～90 d，根据苗木感病程度筛选出苗木死亡率高于 60%的 3 个以上致病性线虫群体。
4.8 接种体扩繁
扩繁方法如下：
a) 从筛选出的线虫群体中分别挑出 10 头松材线虫，接种到长满灰葡萄霉菌丝的 PDA 培养基上，各群体线虫分别接种 4 个培养皿;
b) 在 25 ℃条件下进行恒温培养，每 7 d～10 d 再将线虫接种到新的有灰葡萄霉菌丝的 PDA 培养基。
4.9 线虫悬液制备
制备方法如下：
a) 用 8 mL 蒸馏水分2 次连续冲洗生长良好的各群体松材线虫培养皿，洗液转入离心管中;
b) 吸取 10 μL 线虫洗液置于40×光学显微镜下进行线虫计数，然后用蒸馏水将线虫洗液调整至密度均为 2.0×104 头/mL 线虫悬液;
c) 采用等体积比混合方式，将各群体线虫悬液混合。
5 室内抗性鉴定
5.1 环境条件
温度30 ℃~35 ℃,空气湿度60%～70%，光照强度8 000 1x～12 000 1x。
5.2 试验设计
采用随机区组试验设计，以黑松等高感松属树种接种处理和等体积蒸馏水处理为对照，每处理30株苗木，3次重复。
5.3 苗木选择
以速生、丰产及抗病潜力较好的马尾松成年优树为繁殖材料，利用茎芽组织培养方法获取离体再生试管苗，待苗木移栽至苗圃8个月时，选择生长健壮、无病虫害的马尾松组培容器苗。
5.4 接种方法
在距离组培苗茎部3cm～5cm处，用细纹锯齿擦伤，将微量移液枪从伤口的下部向上部缓缓地接种，每株接种线虫悬液200 μL。
5.5 接种后管理
接种后苗木管理按DB 45/T 1709有关规定执行。
5.6 病情调查
5.6.1 当接种 10 d～30 d 对照品种发病达 7 级时，每6 d 调查试验品系的病情 1 次，直到接种 60 d 结束。
5.6.2 参照苗木病情分级(参见附录 A)，分别统计混合群体松材线虫的发病情况，填写苗木病情调查记录表见附录 B。
6 抗性评价
6.1 评价方法
6.1.1 根据 5.6 病情调查结果，计算试验品种对混合群体松材线虫的抗性频率，抗性频率(RF)根据公式(1)计算。
式中：
RF——抗性频率，单位为百分比(%);
i——抗性病情级别;
ni——各抗性病情级别病株数，单位为株;
N——调查统计总株数，单位为株。
6.1.2 根据抗性频率按照附录 C 划分苗木抗病性等级。
6.1.3 根据抗性评价按照附录 D 输出抗性鉴定结果。
6.2 有效性判别
6.2.1 当对照品种抗性频率小于 40%时，该批次抗性评价判定为有效。
6.2.2 在重复 3 次抗性评价中，出现评价结果差异的，以较低抗病级别指标作为优先确定;抗性评价级别相差 2 个及以上时，则需重新进行抗性评价。
7 试验材料处理
7.1 材料处理
鉴定完成后，线虫悬液和感病植株等材料的处理应符合GB/T 23477有关规定。
7.2 抗病植株处理
对抗病植株进行保护并继续观察，筛选出抗病植株。
8 档案管理
及时收集、记录马尾松组培苗松材线虫病室内鉴定过程中的信息及表格。
附 录 A
(资料性)
苗木病情分级参照表
苗木病情分级参照见表A.1。
表A.1 苗木病情分级参照表
附 录 B
(资料性)
苗木病情调查记录表
苗木病情调查表见表B.1。
表B.1 苗木病情调查记录表
附 录 C
(资料性)
苗木抗病性等级划分表
抗病性等级划分见表C.1。
表C.1 苗木抗病性等级划分表
附 录 D
(资料性)
马尾松组培苗松材线虫病抗性鉴定结果表
松材线虫病抗性鉴定结果见表D.1。
表D.1 马尾松组培苗松材线虫病抗性鉴定结果表
