T/GXAS 1023-2025 金花茶杂交新品种选育技术规程

　　GXAS

　　团 体 标 准

　　T/GXAS 1023—2025

　　金花茶杂交新品种选育技术规程

　　Technical code of pract ice for breed ing hybr id new var iet ies of

　　Sect.Chry santha

　　2025 - 06 - 27 发布 2025 - 07 - 03 实施

　　广西标准化协会 发 布

　　前 言

　　本文件参照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由广西林学会提出、归口并宣贯。

　　本文件起草单位：广西壮族自治区林业科学研究院、桂林市茶花岛花卉种源有限公司、广西和信园林工程有限公司。

　　本文件主要起草人：蓝金宣、韦晓娟、赵志珩、梁晓静、刘凯、李开祥、马锦林、于松毛、肖玉菲、杨德任、曾祥艳、林茂、伍思宇、黄晓露、梁文汇、杨卓颖、张幸、李冰、王坤、武建云、李慧娟、谭春生、刘标。

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　　7 花粉采集及贮存

　　7.1 花粉采集及处理

　　在父本植株上采集发育好、花蕾膨大但尚未完全开放的枝条，放入盛有清水的容器中，置于通光良好、干燥无风的室内，用干净、透明的容器分单系隔离。培养2 d～3 d，待花朵开放、花药破裂后及时按单系收集花粉，置于玻璃试管、玻璃瓶或牛皮纸袋等容器内，并做好标记。

　　7.2 花粉贮存

　　采集的花粉宜当天使用，也可在1 ℃~5 ℃低温下干燥贮存，时间不超过10 d。

　　8 杂交方法与管理

　　8.1 去雄与套袋

　　在花蕾接近成熟时，宜选择晴天上午9 :00～11 :00，选择母本植株上部即将开放花药未裂开前的花蕾50朵以上，用镊子拨开花瓣，去除雄蕊并套上长×宽为11 cm×18 cm的硫酸纸袋，做好标记。

　　8.2 授粉

　　8.2.1 授粉时间

　　当柱头已具可授性时授粉。

　　8.2.2 授粉方法

　　用干净药用棉签沾取按第6章规定收集的父本花粉涂在母本雌蕊的柱头上，重复2～3次直至肉眼看到柱头上沾有花粉。

　　8.2.3 授粉后套袋与标记

　　授粉后随即套上长×宽为11 cm×18 cm的硫酸纸袋，并做好标记。

　　8.3 杂交后管理

　　8.3.1 去袋

　　授粉7 d～10 d柱头枯萎后应去除套袋，授粉30 d～40 d统计座果率，金花茶杂交授粉结果统计表见附录A。

　　8.3.2 水肥管理

　　按LY/T 2956的规定执行。

　　9 杂交果采收与种子处理

　　9.1 采收

　　10月底～11月初，果皮黄绿色或淡紫色时，及时采收杂交果实，采收后果实置室内分开晾晒，统计成果率，金花茶杂交授粉结果统计表见附录A。

　　9.2 种子处理

　　果实微裂时取出种子，进行沙藏或随采随播。

　　10 苗木培育

　　按LY/T 2751的规定执行。

　　11 苗期鉴别

　　11.1 鉴别时间

　　种子发芽后90 d，叶形稳定后进行新品种鉴别。

　　11.2 形态鉴别

　　11.2.1 叶

　　观察、测量、比较和分析叶片着生状态、叶长、叶宽、叶片大小、叶形、侧脉对数、叶色、叶面隆起性、叶身形态、叶片质地、叶齿锐度、叶齿密度、叶齿深度、叶基、叶尖、叶缘形态等;鉴定方法按GB/T 26911的规定执行，或与父本、母本对照有无差异性。

　　11.2.2 芽

　　观察、测量、比较和分析嫩芽颜色、顶芽着生方式、芽的形态等。嫩芽颜色、顶芽着生方式鉴定方法按GB/T 26911的规定执行。芽的形状等与父本、母本对照有无差异性。

　　11.2.3 托叶

　　观察、测量、比较和分析托叶颜色、形态等，与父本、母本对照有无差异性。

　　11.2.4 枝条

　　观察、测量、比较和分析枝条茸毛、形态等，与父本、母本对照有无差异性。

　　11.3 分子技术鉴定

　　通过形态鉴别发现苗木出现与父本、母本不同的表型后，初步确认为新品种，可采用SSR分子标记法进一步进行杂交种早期鉴定，苗期鉴定SSR分子标记法见附录B。

　　12 新品种培育及性状观测

　　初步确定后的新品种培育按LY/T 2751、LY/T 2956的规定执行;新品种性状观测按GB/T 26911的规定执行。

　　13 新品种申报

　　通过性状观测确认为金花茶杂交新品种后，报有关部门申请审定。

　　14 档案管理

　　建立生产技术管理档案记录杂交组合及杂交授粉情况、杂交亲本与杂交后代性状观测(父本、母本和子代叶、芽、托叶、枝条性状对比表见附录C)等。技术档案应有专人记载，技术负责人审查后存档。

　　A

　　A

　　附 录 A

　　(资料性)

　　金花茶杂交授粉结果统计表

　　金花茶杂交授粉结果统计表见表A.1。

　　表 A.1 金花茶杂交授粉结果统计表

　　统计人： 统计日期：

　　B

　　B

　　附 录 B

　　(资料性)

　　苗期鉴定 SSR 分子标记法

　　B.1 样品采集和处理

　　采集培育6个月的杂交F1代幼苗和杂交组合亲本(即母本和父本)的新鲜叶片放入塑料样品袋中，做好标记，放入0 ℃~8 ℃保温箱中，带回实验室，于-18 ℃及以下条件保存。

　　B.2 DNA 提取

　　B.2.1 叶片材料采用液氮研磨成粉末状，采用优化改进的CTAB法提取总DNA备用，具体步骤如下：

　　a) 取样本不多于 100 mg 于 1.5 mL EP 管中，加入 CTAB 提取液(2%CTAB，NaCl 0.01M，EDTA 20 mM，Tris 100 mM，pH8.0)700 μL 和 RNA 酶 6 μL，65 ℃裂解 20 min;

　　b) 取出 EP 管，放至常温，加入 Buffer BDP700 μL，振荡混合，静置 2 min～3 min 至液体分层;

　　c) 12 000 g 离心 5 min(若蛋白质含量较高，可吸取上清液加入等体积 Buffer BDP (美基生物， #MC003)重复抽提);

　　d) 小心吸取上层水相 400 μL 于新的 1.5 mL EP 管;

　　e) 加入预冷的异丙醇 500 μL，上下颠倒混匀，室温孵育 10min;

　　f) 12 000 g 离心 5 min，倒掉上清液;

　　g) 加入 75%乙醇 1 mL 重悬沉淀，12 000 g 离心 3 min;

　　h) 弃上清，沉淀于室温晾干;

　　i) 加入 ddH20 30 μL～50 μL 溶解 DNA。

　　B.2.2 通过1.2%琼脂糖凝胶，电压120 V，电泳30 min，于-20 ℃保存备用。

　　B.3 特异引物筛选

　　合成已筛选出金花茶品种分子鉴别特异SSR引物。根据本文件主要起草人前期对金花茶的转录组测序获得的序列数据，共筛选出3个具有稳定多态性的SSR标记引物，如下：

　　——MSCjaH46(5’→3’)：F：AAGAAGAGCAGAGCAACAAGTG，R：CCACACACTTTCCACACTTTTG;退火 55 ℃ ;

　　——NJFUC57(5’→3’)：F：ATAGGTCTTTGTCTGGTT，R：ATGTAGAGGAAGACTGGA;退火 52 ℃ ;

　　——TUGMS28(5’→3’)：F：GTCCCCATTGCTCTTACTTT，R：GACAATCATTGCCACCACAT;退火 53 ℃。

　　B.4 配制SSR 扩增反应体系

　　PCR扩增反应液体积为20 μL，见表B.1。

　　表 B.1 PCR 扩增反应体系

　　B.5 PCR 扩增程序

　　95 ℃预变性4min;95 ℃变性30s，52 ℃~55 ℃退火35s，73 ℃延伸1.0min，共35个循环;4 ℃保存。

　　B.6 PCR 产物的检测

　　采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并拍照保存。

　　B.7 SSR 带谱中 F1代真实性鉴定标准

　　若杂交F1代在任意一对特异引物扩增获得的SSR带谱中出现有父本特征带，则可判断为杂交种;若杂交F1代扩增条带只有母本特征带，未具有父本特征或出现其他新条带，则可判断为自交种或其他杂种。

　　C

　　C

　　附 录 C

　　(资料性)

　　父本、母本和子代叶、芽、托叶、枝条性状对比表

　　父本、母本和子代叶、芽、托叶、枝条性状对比表见表B.1。

　　表 C.1 父本、母本和子代叶、芽、托叶、枝条性状对比表

　　记录人：

　　记录日期：