T/JSBME 0002-2026 细胞分选用纳米磁珠的特性和测量方法

　　ICS 07.120

　　CCS C10

　　团 体 标 准

　　T/JSBME 0002-2026

　　细胞分选用纳米磁珠的特性和测量方法

　　Specification of characteristics and measurement method of magnetic nanobeads for

　　cell separation

　　2026 - 04 - 08 发布 2026 - 04 - 09 实施

　　江苏省生物医学工程学会发布

　　T/JSBME 0002-2026

　　前 言

　　本文件参照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本文件由江苏省生物医学工程学会提出。

　　本文件由江苏省生物医学工程学会归口。

　　本文件起草单位：东南大学，华道(上海)生物医药有限公司，南京东纳生物科技有限公司，中国医学科学院基础医学研究所，南京驯鹿生物医药有限公司，南京市计量监督检测院(国家生物技术药物产业计量测试中心)，江苏省医疗器械检验所，国家纳米科学中心。

　　本文件主要起草人：张宇，张时音，吉永新，余学军，狄升蒙，许海燕，温涛，崔颜，董海姣，武昊安，马明，顾宁，张昕宇，林学勇，胡济民，吴晓春，葛广路 。

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　　引 言

　　磁性纳米材料因其丰富的磁学性能及良好的生物相容性，在生物医学领域具有广泛的应用，如磁共振成像、药物递送、磁热疗、生物分离与检测等。随着纳米生物技术和免疫细胞治疗的快速发展，磁性纳米材料在细胞治疗领域发挥着不可替代的作用，已经成为细胞分选的重要核心材料。为了指导该类材料的研发、生产及应用，本文件提供了基础特性及测量方法。

　　细胞分选用纳米磁珠的粒径一般在 1 nm~100 nm 范围，表面修饰有抗体等特异性功能分子，且以超顺磁性为核心磁学特征。该类磁珠具有很好的特异性，可高效标记目标细胞，同时具有极好的悬浮稳定性，避免了磁珠团聚对细胞分选效率及细胞活性的影响。然而，因为纳米级尺寸以及较弱的磁响应性，不能使用常规磁铁进行分离，须借助磁分选柱强化磁场梯度实现高效分离。现有国内及国际标准虽然给出了磁性纳米材料的通用测量方法，但细胞分选纳米磁珠在具体适用性上存在独特性，因此本文件依据其特有性能建立了适用于上下游应用的特性指标体系及测量方法。

　　由于该类纳米磁珠应用于细胞分选，安全性依据药品检测要求，比如无菌检测(中华人民共和国药典 1101、欧洲药典 2.6.1、美国药典 71 和日本药典4.06 等)、 内毒素检测(中华人民共和国药典 1143、欧洲药典 2.6.14、美国药典 8 和日本药典 4.01 等)、支原体检查法(中华人民共和国药典3301 、欧洲药典 2.6.7、美国药典 63 和日本药典 4.01 等)、不溶性微粒检查法(中华人民共和国药典 0903、欧洲药典 2.9.19、美国药典 788 和日本药典 6.17 等)。这些药典中检测方法基本一致，本文件不再赘述。

　　本文件针对细胞分选纳米磁珠建立了系列的特性指标及对应的测量方法。其他一些相关性能(如对细胞活性及功能等影响)指标未列入本文件，建议在研发阶段予以评价。

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　　细胞分选用纳米磁珠的特性和测量方法

　　1 范围

　　本文件规定了细胞分选用纳米磁珠的特性和测量方法(报告)。

　　本文件适用于粒径在1nm~100 nm范围、表面标记抗体等生物活性分子、用于细胞分选并具有超顺磁性的纳米颗粒。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改版)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 32671.2-2019 胶体体系 zeta电位测量方法 第2部分：光学法

　　GB/T 37966-2019 纳米技术 氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性测量方法

　　GB/T 39729-2020 细胞纯度测定通用要求 流式细胞测定法

　　GB//T 40171-2021 磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则

　　GB/T 42076-2022 生物技术 细胞计数 第1部分：细胞计数方法通则

　　GB/T 44209-2024 纳米技术 多聚糖超顺磁氧化铁溶液铁含量测量 电感耦合等离子体发射光谱法GB/T 29022-2012 粒度分析 动态光散射法(DLS)

　　GB/Z 26082-2010 纳米材料直流磁化率(磁矩)测量方法

　　GB/Z 43592.1-2023纳米技术 磁性纳米材料 第1部分：磁性纳米悬浮液的特性和测量规范WS/T 360-2011 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南

　　ISO 23033:2021 Biotechnology — Analytical methods — General requirements and considerations for the testing and characterization of cellular therapeutic products

　　3 术语和定义

　　GB/Z 43592.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件，为了方便阅读和使用，本文件重复列出了GB/Z 43592.1中部分术语和定义。

　　3.1

　　纳米磁珠 magnetic nanobeads

　　一种表面经过了功能化修饰，包被有生物活性基团的功能化载体，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能快速分散，具有超顺磁性的一种磁性纳米级球状或无定形颗粒物。

　　[来源： GB//T 40171-2021，定义3.1，有修改]

　　3.2

　　粒径 particle size

　　在指定测量条件下用特定的测量方法确定的颗粒的线性尺寸。

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　　[来源：GB/Z 43592.1-2023，定义3.29]

　　3.3

　　水动力直径 hydrodynamic diameter

　　在该流体中与真实颗粒具有相同扩散系数的颗粒的等效直径。

　　[来源：GB/Z 43592.1-2023，定义3.16]

　　3.4

　　粒度分布 particle size distribution颗粒的分布与粒度之间的函数关系

　　注 1：颗粒尺寸分布可以表示为累积分布或分布密度。

　　注 2：颗粒大小分布可以是基于数量的，也可以是基于质量的。

　　[来源：GB/Z 43592.1-2023，定义3.30] 3.5

　　Zeta 电位 zeta potential

　　在滑动面处与体相液体之间形成的电势差。

　　[来源：GB/Z 43592.1-2023，定义3.44]

　　3.6

　　饱和磁化强度 saturation magnetization

　　当将足够高的磁场H 施加到磁性纳米颗粒集合体时纳米颗粒磁矩沿磁场方向达到的恒定磁化值。 [来源：GB/Z 43592.1-2023，定义3.36]

　　3.7

　　流穿液 flow-through

　　在场流分级(如磁场)分离系统中，样品中的分析物悬浮于流动相后，通过分离系统时未被分离机制保留，随流动相主体直接从系统出口流出的液体。

　　3.8

　　细胞纯度 cell purity

　　目标细胞占样本总细胞数量的百分率。

　　[来源：GB/T 39729-2020，定义3.1.2]

　　3.9

　　细胞分选效率 cell sorting efficiency

　　细胞分选后实际回收的目标细胞数量，占分选前原始样本中目标细胞数量的百分比。

　　即：分选前细胞总量×分选前目标细胞纯度/(分选后细胞总量×分选后目标细胞纯度)

　　3.10

　　污染物 contamination

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　　任何非故意引入的、并非原料药或药品生产工艺预期组成部分的物质。

　　注 1：非故意引入的物质可以是化学物质、生化物质、微生物等。

　　[来源：ISO 23033 ：2021，定义3.19，有修改]

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　BCA：2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸( [2,2'-biquinoline]-4,4'-dicarboxylic acid)

　　DLS：动态光散射粒度仪 (dynamic light scattering)

　　EU：内毒素单位(endotoxin unit)

　　NHS：N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide)

　　SQUID：超导量子干涉器磁强计(superconducting quantum interference device)

　　VSM：振动样品磁强计(vibrating sample magnetometry)

　　5 特性和测量方法

　　5.1. 通则

　　对细胞分选用纳米磁珠悬浮液进行质量测量时，主要理化性质、生物学性能和安全性能指标及其测量方法见表1。

　　除非有特殊说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

　　表1 细胞分选用纳米磁珠特性及测量方法

　　5.2. 外观

　　纳米磁珠以稳定分散的悬浮液形式存在，呈棕黄色或棕黑色，透亮且无颗粒聚集。

　　5.3. 水动力直径及粒径分布

　　水动力直径可以体现溶液中颗粒的内核以及表面修饰层与水化层的总体尺寸，还能反映颗粒在溶液中的聚集情况，在溶液中真实粒径及其分布状态。

　　5.3.1. 测量原理

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　　当一束单色激光照射到悬浮液中的颗粒时，会产生散射光。由于颗粒在液体中的布朗运动，各个颗粒散射光的位相或频率会发生随机变化，观察到的散射光是散射体积内所有颗粒散射光的相干叠加，因此散射光强也将随时间涨落。通过分析这些散射光强度随时间涨落的相关性，可得到颗粒的扩散系数，进而根据斯托克斯-爱因斯坦方程计算得到颗粒的流体动力学直径。[5]

　　5.3.2. 仪器、耗材与试剂

　　粒度仪、测试皿、水。

　　仪器处于校准有效期内。

　　5.3.3. 样品准备

　　使用水稀释样品至0.1 mg/mL(以铁浓度计量)，也可增加浓度但不超过1 mg/mL，测量体积不少于1 mL。

　　5.3.4. 测量步骤及结果计算

　　按照GB/T 29022-2012的方法进行测量。将1mL样品加入测试皿中，测试水动力直径，至少进行三次测量，记录每次测量的水动力直径d(nm)和多分散指数PI。计算d和PI的平均值作为测量结果。

　　5.4. Zeta 电位

　　5.4.1. 测量原理

　　通过测量某一特定位置颗粒速度，从而得到颗粒相对于管壁的移动速度和移动方向， 只要已知电极间距和所施加的电位差， 就可得到电泳迁移率， 通过理论计算得到zeta电位[6] 。Zeta电位由带电表面的本质、表面电荷(通常由pH值决定)、溶液的电解质浓度、溶剂与电解质的本质来共同决定[7]。

　　5.4.2. 仪器、耗材与试剂

　　动态光散射仪、测试皿、稀释液;仪器处于校准有效期内。

　　5.4.3. 样品准备

　　稀释样品至0.1 mg/mL，也可增加浓度但不超过1 mg/mL，体积不少于1 mL。样本中含有的电解质、保护剂等成分可能影响测量结果，不同批次样品测量时应保持相同的稀释倍数。

　　5.4.4. 测量步骤及结果计算

　　将稀释后的1mL样品加入测试皿中，进行三次测量，计算Zeta电位平均值及标准偏差。

　　5.5. 铁浓度

　　水溶液体系下磁性纳米颗粒的铁浓度测量按照GB/T 37966-2019附录中的邻菲啰啉分光光度法进行测量，下述是邻菲啰啉分光光度法具体操作步骤。

　　5.5.1. 测量原理

　　使用邻菲啰啉分光光度法进行测试，对样品中纳米磁珠进行酸溶解，用盐酸羟胺将溶液中的Fe3+还原为Fe2+ ，利用Fe2+ 与邻菲啰啉在pH=3~9条件下生成稳定橙红色络合物的原理，通过测量其在510 nm处的吸光度计算铁浓度。

　　5.5.2. 仪器、耗材与试剂

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　　设备耗材：紫外-可见光分光光度计、超声波清洗仪、50 mL和100 mL的容量瓶、比色皿。仪器和计量设备均处于校准有效期内。

　　试剂：盐酸羟胺溶液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液、邻菲啰啉溶液、醋酸-醋酸钠缓冲液配置方法如

　　下：

　　a) 6 mol/L 盐酸溶液：浓盐酸与水体积 1:1 配制;

　　b) 6 mol/L 氢氧化钠溶液：24 g 氢氧化钠溶于水中，定容至 100 mL;

　　c) 10% (m/V)盐酸羟胺溶液：10 g 盐酸羟胺溶于水中，定容至 100 mL;

　　d) 醋酸-醋酸钠缓冲液：27.2 g 醋酸钠与 24 mL 冰醋酸加水稀释，调节 pH=5，定容至 100 mL;

　　e) 0. 1% (m/V)邻菲啰啉溶液：0.1 g 邻菲啰啉溶于水中，定容至 100 mL。

　　5.5.3. 测量步骤及结果计算

　　5.5.3.1. 铁浓度标准曲线绘制

　　取浓度为1000 μg/mL的铁标准溶液0 μL 、20 μL 、40 μL 、60 μL 、80 μL 、100 μL，分别加入盐酸溶液中至2 mL，在超声仪中超声不少于15分钟，所得液体为黄色;加入1 mL盐酸羟胺溶液，再超声不少于5分钟;加入2 mL邻菲啰啉溶液，摇匀后再加入2 mL氢氧化钠溶液，所得液体由淡黄变成红色;加入5 mL醋酸-醋酸钠缓冲液，摇匀静置20分钟;最后加入水至50 mL，即可测试。

　　用紫外-可见光分光光度计测量其在510 nm处的吸光度。将吸光度数据同对应的铁质量浓度进行线性拟合得方程如公式(1)：

　　A = kc + b (1)

　　式中：

　　A —— 溶液在510 nm处的吸光度;

　　k —— 斜率常数;

　　C —— 定容到50 mL后铁的质量浓度(mg/mL);

　　b —— 截距常数。

　　5.5.3.2. 样品测试

　　分别取10 μL、20 μL 、30 μL 样品(其中铁含量不超过100 μg)，经过与铁标准溶液同样的处理方法显色后，定容到50 mL，对其进行吸光度的测量，根据以上方程分别计算出质量浓度，取平均值后折算出待测溶液中铁元素质量浓度，单位为mg/mL。

　　应使用铁单元素标准品。

　　标准曲线线性应大于0.99，应选测试中标准曲线线性范围内中间浓度作为合适浓度，并进行三次重复测试。

　　宜使用已知浓度的参考氧化铁纳米颗粒悬浮液样品作为对照。

　　5.6. 饱和磁化强度

　　5.6.1. 测量原理

　　利用电磁感应定律测量纳米材料的直流磁化率(磁矩) ，通过测量样品在强磁场中的磁矩饱和值推导出饱和磁化强度。直流磁化率测量通常使用超导量子干涉器磁强计(SQUID)或振动样品磁强计(VSM)进行测量。

　　5.6.2. 仪器、耗材与试剂

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　　超导量子干涉器磁强计(SQUID)或振动样品磁强计(VSM)、液体样品管;仪器处于校准有效

　　期内。

　　5.6.3. 样品准备

　　以纳米磁珠悬浮液形式进行测量，铁浓度要求大于1 mg/mL。对于浓度较低的样品，可采用超滤等方式进行浓缩，并采用5.5方法确定铁浓度。

　　注：一般情况下，采用抗体等生物分子对磁性纳米颗粒进行修饰的过程，对饱和磁化强度的影响可忽略，因此也可采用修饰前的磁性纳米颗粒溶液进行测试。

　　5.6.4. 测量步骤及结果计算

　　以VSM为例，取测试样品溶液不低于80 μL，加入液体样品管。参照GB/Z 26082的要求测量磁滞回线，得到饱和磁化强度，按照测试样品中铁质量进行归一化，得到单位质量饱和磁化强度，单位emu/g Fe。因样品具有超顺磁性，所以磁滞回线应通过原点。

　　5.7. 蛋白质偶联量

　　5.7.1. 测量原理

　　抗体等蛋白质与磁性纳米颗粒偶联后，收集未与磁性纳米颗粒偶联的蛋白，参照《中华人民共和国药典》第四部0731蛋白质含量测定法进行测量，应避免干扰物影响测定结果。

　　本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+ ，BCA与Cu+ 结合形成紫色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定样品中蛋白质的含量。

　　5.7.2. 仪器、耗材与试剂

　　仪器设备：恒温仪、紫外-可见光分光光度计或酶标仪、高速离心机或磁力架和磁分离柱，仪器处于校准有效期内。

　　试剂：BCA试剂盒。

　　5.7.3. 样品准备

　　5.7.3.1. 对照品溶液的制备

　　除另有规定外，取牛血清白蛋白对照品或蛋白质含量测定国家标准样品，加水溶解并制成标准溶液。

　　5.7.3.2. 待测品溶液的制备

　　使用磁分离柱分离抗体等蛋白偶联后的纳米磁珠，磁场作用下收集流穿液(磁分离柱下端流出的液体)作为待测溶液。或者使用高速离心方式，获得不含纳米颗粒的上清液作为待测溶液(例如，对于水动力尺寸30 nm-50 nm的磁珠可采用20000×g 、30 分钟离心;对于水动力尺寸70 nm-90 nm的磁珠可采用20000×g 、20 分钟离心)。若上清液中或流传液中含有残留的纳米颗粒会影响BCA的结果，须清除干净。

　　待测溶液可直接取样或稀释后测量(蛋白质浓度应在标准曲线测量范围之内)。

　　BCA法测试蛋白质含量时需考虑干扰因素，如还原剂、金属离子、螯合剂等，尤其是使用了NHS的羧基活化剂，会严重影响BCA法的测试结果，应洗涤干净。

　　5.7.4. 测量步骤与结果计算

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　　具体操作步骤参照《中华人民共和国药典》第四部0731中蛋白质含量测定法及试剂盒说明书进行操作。每个点设立三个平行样本，并计算平均值。

　　蛋白质投料量减去未结合的蛋白质量即为蛋白质偶联量，并计算纳米磁珠单位质量上抗体量(μg/mg)。

　　5.8. 细胞分选效率和纯度

　　5.8.1. 测量原理

　　通过细胞分选用纳米磁珠对目标细胞的特异性生物学特征(如抗原、受体、糖蛋白等)进行靶向标记，经磁分离实现目标细胞与杂细胞的分离，分别对细胞分选的纯度及效率进行测量。

　　细胞分选纯度是分选后目标细胞占总细胞的百分率。采用流式细胞术，依据总细胞与目标细胞在散射光、荧光信号等光学特性上的差异，对分选后目标细胞进行识别、区分与定量计数，得到分选后目标细胞的占比，该值由流式细胞仪给出。

　　细胞分选效率是分选前、后目标细胞数量的比值。采用流式细胞术和细胞计数，分别测量分选前、后的目标细胞占比和总细胞数量，计算分选后获得的目标细胞数量占分选前初始目标细胞数量的百分率。

　　5.8.2. 仪器、耗材与试剂

　　仪器：细胞计数仪或细胞计数板与显微镜、流式细胞仪，仪器处于校准有效期内。

　　试剂：特异性荧光标记抗体或染料。

　　5.8.3. 样品准备

　　参照GB/T 39729-2020中规定的方法测定。

　　应设置阴性对照、 阳性对照、 同型对照、 荧光扣除对照， 用于识别目标细胞并确认目标细胞的染色方案是否正确。

　　使用不含任何荧光染料及计数标准微球的待测细胞样本作为阴性对照。

　　使用已经证明可有效地与待测荧光染料结合的细胞样本作为阳性对照。

　　使用与荧光染料标记的抗体相同种属来源、同种免疫球蛋白的相同亚型的相同剂量抗体染色的细胞样品作为同型对照。

　　使用两个和两个以上的荧光染料或荧光染料标记抗体组合标记细胞样本时， 在完整的染色基础上使用减少一种荧光染料或荧光染料标记抗体进行细胞染色的待测细胞样本作为荧光扣除对照。

　　染色时应避免与磁珠上的抗体使用同一表位的抗体，应使用不同克隆号或不同表位抗体进行流式细胞荧光标记测量。

　　采用两种及以上染料组合方案进行细胞计数时或光学检测通道的电压及增益发生变动时， 需要进行荧光补偿。荧光补偿样品进样完成后， 根据仪器操作软件的指示进行手工方式补偿或自动补偿。

　　5.8.4. 测量步骤及结果计算

　　实验步骤如下：

　　a) 使用细胞计数仪或细胞计数板，按照 GB/T 42076-2022 规定的方法，测量样本的总活细胞浓度和总体积，计算总活细胞数量(Nt)。

　　b) 用待测细胞与纳米磁珠结合，磁场条件下进行磁分离，去掉未结合的细胞。撤掉磁场，收集结合了纳米磁珠的细胞(分选后)。使用细胞计数仪或细胞计数板测量，其数量记为 Ns。

　　c) 参照 GB/T 39729-2020 中规定的方法，采用荧光标记抗体分别对分选前后样本中的目标细胞

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　　进行染色，按照流式细胞仪使用说明操作，测量分选前后细胞中目标细胞亚群所占百分比，分别记为Pt 与 Ps。其中 Ps 即为目标细胞的分选纯度。

　　d) 按照公式(2)计算细胞分选效率：

　　E …………………………(2)

　　式中：

　　E ——目标细胞分选效率;

　　Ns ——分选后所得细胞数量，单位为个;

　　Ps ——分选后所得细胞中目标细胞亚群占比，即为目标细胞的分选纯度;

　　Nt ——分选前总细胞数量，单位为个

　　Pt ——分选前总细胞中目标细胞亚群占比。

　　分离外周全血淋巴细胞亚群时应参考标准 WS/T 360-2024。

　　5.9. 污染物

　　微生物污染会影响细胞活性和功能。微生物检测包括无菌检查、支原体检查和内毒素检查。测量方法和步骤按照《中华人民共和国药典》第四部1101无菌检测方法、3301支原体检查法、1143细菌内毒素检查法。细胞分选纳米磁珠应无菌、无支原体，低内毒素。

　　5.10. 稳定性

　　纳米磁珠的分选性能会随着储存条件而发生变化，某一次测量数据的绝对偏差与原数据的百分比能够体现样品变化结果对原值的偏离程度，因此，采用相对偏差来衡量样品的稳定性。

　　水动力尺寸(5.3)和细胞分选效率与纯度(5.8)作为稳定性的监测指标，应满足产品使用要求。

　　6 报告

　　测量评价报告应包含但不限于以下信息：

　　a) 样品信息：测量样品名称、数量等;

　　b) 测量依据(本文件编号);

　　c) 测量仪器(仪器处于校准有效期内);

　　d) 样品测量条件;

　　e) 测量结果;

　　f) 测量机构：测量人员、校验人员、测量日期、机构名称、地址等。

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　　附录 A

　　(资料性附录)

　　细胞分选用纳米磁珠的特性和测量方法示例

　　A.1 抗体偶联纳米磁珠

　　一种已经包被抗体的磁性纳米颗粒，结构如图 A. 1 所示。

　　图 A.1 包被抗体的磁性纳米颗粒示意图

　　A.2 水动力直径及粒径分布(动态光散射法)

　　A.2.1 仪器

　　动态光散射仪，仪器处于校准有效期内。

　　A.2.2 测量步骤

　　将抗体偶联纳米磁珠用水稀释至 0.1 mg/mL Fe 浓度。取 1 mL 加入测试皿中，测试参数中材料选择

　　四氧化三铁，分散介质选择水，进行测试。

　　A.2.3 结果

　　动态光散射统计结果显示(如图 A.2 所示)：

　　图 A.2 抗体偶联纳米磁珠的动态光散射测定

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　　dI ——强度平均水动力直径;

　　PI ——多分散指数。

　　A.3 Zeta电位

　　A.3.1 仪器

　　动态光散射仪，仪器处于校准有效期内。

　　A.3.2 测量步骤

　　将抗体偶联纳米磁珠用水稀释至 0.1 mg/mL Fe 浓度，取 1 mL 样品加入电位池中，测试参数中材料

　　选择四氧化三铁，分散介质选择水，进行三次测量。

　　A.3.3 结果

　　如图 A.3 所示，Zeta 电位：-15.95 ± 0.884 mV。

　　图 A.3 抗体偶联纳米磁珠的 Zeta 电位测定

　　A.4 铁浓度

　　A.4.1 仪器

　　25 Hz 超声波清洗仪、紫外-可见光分光光度计、50 mL 容量瓶;仪器处于校准有效期内。

　　A.4.2 试剂

　　盐酸溶液、盐酸羟胺溶液、邻菲啰啉溶液、氢氧化钠溶液、醋酸-醋酸钠缓冲液、Fe 标准溶液(国家标准样品)。

　　A.4.3 测量步骤

　　A.4.3.1 铁浓度标准曲线绘制

　　分别取浓度为 1000 μg/mL 的铁单元素标准溶液 0 mL 、0.02 mL 、0.04 mL 、0.06 mL 、0.08 mL 、0.1 mL，分别加入 2 mL 6 mol/L 盐酸溶液，然后在超声仪中超声不低于 30 min，所得液体为黄色;分别加入 1 mL 10% (m/V)盐酸羟胺溶液，再超声不低于 15 min;分别加入 2 mL 0. 1% (m/V)邻菲啰啉溶液，摇匀后再加入 2 mL 6 mol·L-1 氢氧化钠溶液，所得液体变成红色;分别加入 5 mL 醋酸-醋酸钠缓冲溶液，摇匀静置 20 min，最后加入水至 50 mL 刻度，进行测试。

　　用紫外-可见光分光光度计测量其在 510 nm 处的吸光度。将吸光度数据同对应的铁质量浓度进行线性拟合得 C-A 直线方程：

　　A = 0.004 C + 0.0117

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　　式中：

　　C —— 定容到 50 mL 后铁的质量浓度(μg/mL)

　　A —— 溶液在 510 nm 处的吸光度。

　　A.4.3.2 样品测试

　　分别取 30 μL 、40 μL 、50 μL 样品，每个体积设置三组平行样本，经过与铁溶液标准样品相同的处理方法显色后，定容到 50 mL，之后对其吸光度进行测量，并根据以上方程分别计算出质量浓度，取平均值后折算出待测溶液的铁元素质量浓度，如表 A. 1 所示。

　　表 A.1 铁浓度计算

　　A.5 饱和磁化强度

　　A.5.1 仪器

　　振动样品磁强计(VSM);仪器处于校准有效期内。

　　A.5.2 测量步骤

　　取 80 μL 样品，置入VSM 测试样品管。按 GB/Z 26082 的要求绘制磁滞回线，得到饱和磁化强度。

　　A.5.3 结果

　　如图 A.4 所示：

　　图 A.4 磁性纳米颗粒的磁滞回线及饱和磁化强度值A.6 抗体偶联量

　　A.6.1 仪器与试剂

　　仪器：酶标仪、恒温仪;仪器处于校准有效期内。

　　试剂：BCA 快速检测试剂盒。

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　　A.6.2 测量步骤

　　精密量取浓度为 0.5 mg/mL 的对照品溶液 0 μL 、1 μL 、2 μL 、4 μL 、8 μL 、12 μL 、16 μL 、20 μL至96 孔板，加水至总体积为20 μL，同时取待测样品20 μL;分别加入BCA 工作液200 μL，立即混匀，置 37℃恒温箱中孵育 30 分钟，使用酶标仪测试 562 nm 波长处的吸光度;同时以 0 μL 孔作为空白，以对照品溶液浓度和吸光度计算线性回归方程(如图 A.5 所示)，并计算样品溶液中的蛋白质浓度。

　　注：每个点设立三个平行样本，取平均值计算(如表 A.2 所示)。

　　图 A.5 抗体对照品标准曲线

　　表 A.2 抗体偶联量计算

　　A.7 细胞分选效率和纯度

　　A.7.1 仪器与试剂

　　仪器：细胞计数仪、流式细胞仪、磁铁及磁分选柱;仪器处于校准有效期内。

　　试剂：待测细胞、荧光抗体、抗体偶联纳米磁珠。

　　A.7.2 测量步骤

　　A.7.2.1 测试分选前细胞总数

　　取待测细胞，使用细胞计数仪计数，计算细胞总数。(见表 A.3) A.7.2.2 细胞分离

　　将准备好的待测细胞与抗体偶联纳米磁珠孵育，磁场条件下使用磁分选柱进行磁分离，去掉未标记的细胞。撤掉磁场，收集结合了纳米磁珠的细胞。并使用细胞计数仪计数，以获得分选后的细胞总数。

　　A.7.2.3 流式细胞仪测试细胞纯度(以 CD8+T 细胞为例)

　　将分选前后的细胞分别进行染色，依据 WS/T 360-2011 选取 CD45/CD3/CD8 组合荧光抗体标记细胞。利用流式细胞仪进行测试。根据 CD45 强阳性细胞群划定区域，通过 CD3/CD8 散点图中 CD3+ CD8+双阳性细胞群确定 CD8+ T 细胞相对计数(%)。进而计算细胞分选后的细胞纯度及目的细胞的分选效率(如图 A.6 所示)。

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　　图 A.6 流式细胞仪细胞亚群散点图

　　表 A.3 细胞分选效率及纯度

　　Nt=8.31×106，Pt=16.94%，Ns =1.46×106 ，Ps =95.38%

　　依据公式 2 计算分选效率 E=98.91%

　　分选纯度为仪器计算给出，为 95.38%。

　　A.8 污染物

　　样品每瓶容量2 mL，分别参照中华人民共和国药典<1101> 、<1143> 、<3301>测试，结果如表4：

　　表 A.4 污染物测试结果

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　　参考文献

　　[ 1] 0731 蛋白质含量测定法-中华人民共和国药典. 中国医药科技出版社，2025

　　[2] 1101 无菌检测法-中华人民共和国药典. 中国医药科技出版社，2025

　　[3] 1143 细菌内毒素检查法-中华人民共和国药典. 中国医药科技出版社，2025

　　[4] 3301 支原体检查法-中华人民共和国药典. 中国医药科技出版社，2025

　　[5] GB/T 44223-2024 纳米技术 动态光散射法 粒度分析仪技术要求

　　[6] GB/T 32671.2-2019 胶体体系 zeta电位测量方法 第 2 部 分：光学法

　　[7] GB/Z 42353-2023 Zeta 电位测定操作指南