江西省地方标准
DB36/T 1426—2021
作物青枯病菌LAMP 检测技术规程
Technique rules for LAMP detection of ralstonia solanacearum on tuber crops
2021 - 06 - 30 发布 2022 - 01 - 01 实施
江西省市场监督管理局 发布
前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起
草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由江西省农业农村厅提出并归口。
本文件起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所、江西生物科技职业学院、瑞昌市农业农村局。
本文件主要起草人：李信申、曾荣、华菊玲、黄小梅、沈爱喜、陈建、黄建华、洪芸。
1 范围
本文件规定了作物（主要指芝麻、马铃薯、甘薯、花生、番茄、茄子、辣椒等）青枯病菌（Ralstonia
solanacearum）的LAMP检测技术。
本文件适用于作物（主要指芝麻、马铃薯、甘薯、花生、番茄、茄子、辣椒等）青枯病菌的定性检
测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2601 植物病原细菌常规检测规范
SN/T 3296 植物病原细菌分子生物学检测规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
LAMP 扩增技术 Loop-mediated isothermal amplification
环介导等温扩增技术（简称LAMP扩增技术）是一种可于特定恒温条件下，实现短时间内对靶标序列
高效扩增的技术。检测结果通过肉眼观察绿色荧光的生成进行判断。该技术具有“简便、快速、精确、
低价”的特点。已广泛用于病害的诊断及病原菌的定性定量检测。
4 样品
4.1 采集
将新鲜的疑似病株用吸水纸包好，整株带回实验室，保存于4℃冰箱备用。
4.2 处理
截取适量待检测样品，剪碎后悬浮于装有适量无菌水的试管中，静置30 min后，取悬浮液；或加适
量无菌水研磨，静置5 min，取上清液。以悬浮液或上清液为模板，以无菌水为空白对照，进行LAMP
检测。
5 LAMP 扩增
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5.1 扩增模板
以提取的疑似作物病株样品组织悬浮液或上清液为模板，以模式菌株GMI1000菌悬液为阳性模板，
以无菌水为阴性模板，采用特异性引物（附件A）对待测样品进行LAMP检测。
5.2 扩增体系
扩增反应在25 μL体系中进行，各组分如下：2.5 μL 10×Thermo Pol buffer[20 mM Tris-HCl (PH8.8),
10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100]，3.5 μL 10 mM dNTP，1.5 μL 100 mM
MgSO4，5 μL 5×LAMP引物混合物（附件A），1 μL样本悬浮液或上清液，1 μL Bst DNA聚合酶2.0（8000
U/mL）, 4 μL 5 M 甜菜碱, 1 μL 12.5 mM MnCl2， 1 μL 0.6 μM钙黄绿素，去离子水补足至25 μL。
5.3 扩增条件
扩增条件为: 60℃扩增60 min，80℃ 5 min使酶热变性失活终止反应。
6 结果判断
6.1 肉眼观察
LAMP反应结束后，通过观察反应液颜色的变化进行判断。颜色变绿色为阳性结果，无颜色变化（仍
为桔红色）为阴性结果。
6.2 电泳检测
条件允许，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。取3 μL反应产物，加入0.5 μL 6倍上样缓冲液（6×loading
buffer）, 混匀，在2%的琼脂糖凝胶上90 V恒压电泳30 min, 凝胶成像仪扫描拍照进行判断。出现梯形
条带为阳性结果，没有出现条带为阴性结果。
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