中华人民共和国国家标准 GB4789.38—2025 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 2025-03-16发布2025-09-16实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局发布前言本标准代替GB4789.38—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》。 本标准与GB4789.38—2012相比,主要变化如下: ———修改了范围; ———删除了术语和定义; ———增加了检验原理; ———修改了设备和材料、培养基和试剂; ———修改了检验程序、操作步骤、结果与报告和附录。 1 GB4789.38—2025 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 1 范围本标准规定了食品中大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)计数的方法。 本标准第一法适用于大肠埃希氏菌含量较低的食品中大肠埃希氏菌的计数;第二法适用于大肠埃希氏菌含量较高的食品中大肠埃希氏菌的计数,不适用于贝类及产品中大肠埃希氏菌的计数。 2 检验原理大肠埃希氏菌在44.5℃发酵乳糖产酸产气,具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性,能分解5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷,在胰蛋白胨胆盐X-葡萄糖醛酸苷(TryptoneBileX-glucuronide,TBX)琼脂上形成蓝绿色菌落。根据大肠埃希氏菌的以上特性,对其进行MPN 计数和平板计数。 注:绝大多数大肠埃希氏菌具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性,但大肠埃希氏菌O157等菌株没有β-葡萄糖醛酸苷酶活性。另外,肠杆菌科内一些志贺氏菌、沙门氏菌等菌株也具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性。 3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。 3.1 恒温培养箱:36℃±1℃。 3.2 冰箱:2℃~8℃。 3.3 恒温水浴箱:44.5℃±0.2℃。 3.4 恒温装置:48℃±2℃。 3.5 天平:感量0.1g。 3.6 均质器及无菌均质袋、均质杯,振荡器。 3.7 试管:15mm×150mm、18mm×180mm 或其他合适规格,以及小倒管(杜氏管)或其他合适的产气收集装置。 3.8 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、2mL(具0.02mL刻度)、5mL(具0.05mL刻度)、10mL(具 0.1mL刻度)或微量移液器及无菌吸头。 3.9 无菌锥形瓶:容量500mL。 3.10 无菌培养皿:直径90mm。 3.11 pH 计或精密pH 试纸。 3.12 无菌接种环:10μL(直径约3mm)。 4 培养基和试剂 4.1 磷酸盐缓冲液:见附录A 中A.1。 4.2 生理盐水:见A.2。 1 GB4789.38—2025 4.3 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤:见A.3。 4.4 EC肉汤:见A.4。 4.5 胰蛋白胨胆盐X-葡萄糖醛酸苷(TBX)琼脂:见A.5。 4.6 1mol/LNaOH:见A.6。 4.7 1mol/LHCl:见A.7。 第一法大肠埃希氏菌MPN 计数法 5 检验程序大肠埃希氏菌MPN 计数法的检验程序见图1。 图1 大肠埃希氏菌MPN 计数法检验程序 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品:无菌操作称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min;或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理 2 GB4789.38—2025 盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。 6.1.2 液体样品:用无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中充分混匀,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。当样品不适宜进行体积取样时,按6.1.1操作。 6.1.3 必要时用1mol/LNaOH 或1mol/LHCl,调节样品匀液或液体样品原液的pH 至6.5~7.5。 6.1.4 用无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入装有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),将试管在振荡器上振荡混匀,制成 1∶100的样品匀液。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计,参照6.1.4的操作,依次制??-10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支无菌吸管或吸头。 6.2 初发酵试验每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管 LST肉汤(贝类及产品每个稀释度接种5管LST肉汤),每管LST肉汤接种1mL样品匀液(如接种体积超过1mL,则加到等体积的双料LST肉汤中)。从制备样品匀液开始至接种至LST肉汤完毕,全过程不得超过15min。将已接种样品的LST肉汤管置于36℃±1 ℃培养24h±2h,检查产气情况。小倒管或产气收集装置内有气泡产生,或轻轻振摇LST 肉汤管可见试管内有细密气泡不断上升者,判断为产气,产气者进行复发酵试验。如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验;培养至 48h±2h,仍未产气者判断为大肠埃希氏菌阴性。若培养至48h±2h,所有LST肉汤管均未产气,按照附录B或附录C中的MPN 检索表,报告每克(毫升)样品中大肠埃希氏菌的MPN 值,以MPN/g (mL)表示。 6.3 复发酵试验轻轻振摇各产气的LST肉汤管,分别用接种环取培养物1环,转种至EC肉汤管中,放入带盖的水浴箱内。水浴箱的水面至少高于EC肉汤培养基液面1cm~2cm,44.5℃±0.2 ℃培养24h±2h,检查产气情况,如未见产气则继续培养至48h±2h。记录48h±2h内所有产气的EC肉汤管数,并进行确认试验。若培养至48h±2h,所有EC肉汤管均未产气,判断为大肠埃希氏菌阴性,按照附录B或附录C中的MPN 检索表,报告每克(毫升)样品中大肠埃希氏菌的MPN 值,以MPN/g(mL)表示。 6.4 确认试验轻轻振摇各产气的EC肉汤管,分别用接种环取培养物划线接种于TBX琼脂平板,36 ℃±1 ℃培养18h~24h,观察TBX琼脂平板上的菌落,大肠埃希氏菌在TBX琼脂平板上的菌落为蓝绿色。TBX 琼脂平板上有蓝绿色菌落者,其对应的EC肉汤产气管为大肠埃希氏菌阳性,否则为阴性。 7 结果与报告依据3个适宜的连续稀释度中大肠埃希氏菌的阳性管数,按照附录B或附录C中的MPN 检索表, 报告每克(毫升)样品中大肠埃希氏菌的MPN 值,以MPN/g(mL)表示。 3 GB4789.38—2025 第二法大肠埃希氏菌平板计数法 8 检验程序大肠埃希氏菌平板计数法的检验程序见图2。 图2 大肠埃希氏菌平板计数法检验程序 9 操作步骤 9.1 样品的稀释按6.1进行。 9.2 接种与培养 9.2.1 根据对样品污染状况的估计,选取2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌培养皿,每皿1mL。同时取磷酸盐缓冲液或生理盐水加入2个无菌培养皿作空白对照,每皿1mL。 9.2.2 尽快将冷却至48℃±2℃的TBX琼脂倾注于培养皿中,每皿15mL~20mL。小心旋转培养皿,将培养基与接种的样品匀液充分混匀,水平静置待其凝固。从制备样品匀液开始至倾注TBX琼脂完毕,全过程不得超过15min。琼脂凝固后翻转平板,置于36℃±1℃培养18h~24h。 9.3 平板菌落数的选择 TBX琼脂平板上大肠埃希氏菌的典型菌落为蓝绿色,选择典型菌落数在15CFU~150CFU 之间的平板,对典型菌落进行计数。 9.4 大肠埃希氏菌菌落数的计算 9.4.1 若只有1个稀释度的平板上典型菌落数在计数范围内,以该稀释度典型菌落数的平均值,再乘以相应稀释倍数进行结果计算。 9.4.2 若有两个连续稀释度的平板上典型菌落数在计数范围内时,结果按式(1)计算: 4 GB4789.38—2025 N = ΣC (n1 +0.1n2)d…………………………(1) 式中: N ———样品中大肠埃希氏菌的菌落数; C ———所选平板上的典型菌落数; n1 ———第一稀释度(低稀释倍数)所选平板个数; n2 ———第二稀释度(高稀释倍数)所选平板个数; d ———稀释因子(第一稀释度)。 9.4.3 若所有稀释度的平板上典型菌落数均大于150CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他稀释度的平板菌落数可记录为多不可计,结果按最高稀释度典型菌落数的平均值乘以相应稀释倍数计算。 9.4.4 若所有稀释度的平板上典型菌落数均小于15CFU,则对稀释度最低的平板进行计数,结果按最低稀释度典型菌落数的平均值乘以相应稀释倍数计算。 9.4.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无典型菌落生长,则结果按小于1乘以最低稀释倍数计算。 9.4.6 若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在15CFU~150CFU 之间,其中一部分小于15CFU, 一部分大于150CFU 时,则以最接近15CFU 或150CFU 的典型菌落数平均值乘以相应的稀释倍数进行结果计算。 10 结果与报告 10.1 大肠埃希氏菌的菌落数小于100CFU 时,按“四舍五入”的原则修约,以整数报告。 10.2 大肠埃希氏菌的菌落数大于或等于100CFU 时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前 2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,保留两位有效数字。 10.3 若空白对照上有菌落生长,则此次检验结果无效。 10.4 称重取样以CFU/g为单位报告结果,体积取样以CFU/mL为单位报告结果。 5 GB4789.38—2025 附录 A 培养基和试剂 A.1 磷酸盐缓冲液 A.1.1 成分磷酸二氢钾 34.0g 蒸馏水 500mL A.1.2 制法贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水(或其他符合要求的实验用水,下同)中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH 至7.2±0.2,用蒸馏水稀释至1000mL,密封贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1000 mL,分装于适宜容器中,121 ℃ 高压灭菌 15min,用作样品稀释。 A.2 生理盐水 A.2.1 成分氯化钠 8.5g 蒸馏水 1000mL A.2.2 制法将氯化钠在蒸馏水中溶解,121℃高压灭菌15min。 A.3 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤 A.3.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨 20.0g 氯化钠 5.0g 乳糖 5.0g 磷酸氢二钾 2.75g 磷酸二氢钾 2.75g 月桂基硫酸钠 0.1g 蒸馏水 1000mL A.3.2 制法将各成分(双料LST肉汤除蒸馏水外,各成分的用量加倍)加到蒸馏水中加热溶解,必要时调节 pH。分装至有小倒管的试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min,灭菌后培养基在25℃时的pH 为6.8±0.2。 A.4 EC肉汤 A.4.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨 2 0.0g 6 GB4789.38—2025 3号胆盐或混合胆盐 1.5g 乳糖 5 .0g 磷酸氢二钾 4.0g 磷酸二氢钾 1.5g 氯化钠 5 .0g 蒸馏水 1 000mL A.4.2 制法将各成分在蒸馏水中加热溶解,必要时调节pH。分装至有小倒管的试管中,每管10mL。121 ℃ 高压灭菌15min,灭菌后培养基在25℃时的pH 为6.9±0.2。 A.5 胰蛋白胨胆盐X-葡萄糖醛酸苷(TBX)琼脂 A.5.1 成分胰蛋白胨 20.0g 3号胆盐 1.5g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷(BCIG)环己胺盐或钠盐 144μmol 琼脂 9.0g~18.0g 蒸馏水 1000mL A.5.2 制法在2.5mL95%的乙醇中加入0.5mL1mol/L的氢氧化钠溶液,然后再加入144μmol(0.075g)的 BCIG环己胺盐混匀,与其他成分一并加入蒸馏水中。或者将144μmol的BCIG钠盐,与其他成分一并加入蒸馏水中。加热至完全溶解,必要时调节pH。121 ℃高压灭菌15min,灭菌后培养基在25℃ 时的pH 为7.2±0.2。灭菌后的培养基可在冰箱密封避光保存不超过1个月。 A.6 1mol/LNaOH A.6.1 成分氢氧化钠 40.0g 蒸馏水 1000mL A.6.2 制法称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中。 A.7 1mol/LHCl A.7.1 成分浓盐酸 89mL 蒸馏水 1000mL A.7.2 制法量取浓盐酸89mL,用蒸馏水稀释至1000mL。 7 GB4789.38—2025 附录 B 食品中大肠埃希氏菌最可能数(MPN)检索表每克(毫升)食品检样中大肠埃希氏菌最可能数(MPN)的检索见表B.1。 表B.1 食品中大肠埃希氏菌最可能数(MPN)检索表阳性管数 0.1 0.01 0.001 MPN 95%可信限下限上限阳性管数 0.1 0.01 0.001 MPN 95%可信限下限上限 0 0 0 <3.0 — 9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 — 注1:本表采用3个稀释度,每个稀释度接种3管,3个稀释度中每管接种的样品量分别为0.1g(mL)、0.01g (mL)、0.001g(mL)。 注2:3个稀释度中接种的样品量改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数值要相应缩小10倍;如改用 0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,则表内数值要相应扩大10倍。以此类推。 注3:必要时,本表的数值可乘以100,报告每100克(毫升)检样中大肠埃希氏菌最可能数,以MPN/100g(mL) 表示。 8 GB4789.38—2025 附录 C 贝类及产品中大肠埃希氏菌最可能数(MPN)检索表每克(毫升)贝类及产品检样中大肠埃希氏菌最可能数(MPN)的检索见表C.1。 表C.1 贝类及产品中大肠埃希氏菌最可能数(MPN)检索表阳性管数 0.1 0.01 0.001 MPN 95%可信限下限上限阳性管数 0.1 0.01 0.001 MPN 95%可信限下限上限 0 0 0 <1.8 — 6.8 2 2 2 14 5.9 36 0 0 1 1.8 0.09 6.8 2 3 0 12 4.1 26 0 1 0 1.8 0.09 6.9 2 3 1 14 5.9 36 0 1 1 3.6 0.7 10 2 4 0 15 5.9 36 0 2 0 3.7 0.7 10 3 0 0 7.8 2.1 22 0 2 1 5.5 1.8 15 3 0 1 11 3.5 23 0 3 0 5.6 1.8 15 3 0 2 13 5.6 35 1 0 0 2.0 0.1 10 3 1 0 11 3.5 26 1 0 1 4.0 0.7 10 3 1 1 14 5.6 36 1 0 2 6.0 1.8 15 3 1 2 17 6.0 36 1 1 0 4.0 0.7 12 3 2 0 14 5.7 36 1 1 1 6.1 1.8 15 3 2 1 17 6.8 40 1 1 2 8.1 3.4 22 3 2 2 20 6.8 40 1 2 0 6.1 1.8 15 3 3 0 17 6.8 40 1 2 1 8.2 3.4 22 3 3 1 21 6.8 40 1 3 0 8.3 3.4 22 3 3 2 24 9.8 70 1 3 1 10 3.5 22 3 4 0 21 6.8 40 1 4 0 11 3.5 22 3 4 1 24 9.8 70 2 0 0 4.5 0.79 15 3 5 0 25 9.8 70 2 0 1 6.8 1.8 15 4 0 0 13 4.1 35 2 0 2 9.1 3.4 22 4 0 1 17 5.9 36 2 1 0 6.8 1.8 17 4 0 2 21 6.8 40 2 1 1 9.2 3.4 22 4 0 3 25 9.8 70 2 1 2 12 4.1 26 4 1 0 17 6.0 40 2 2 0 9.3 3.4 22 4 1 1 21 6.8 42 2 2 1 12 4.1 26 4 1 2 26 9.8 70 9 GB4789.38—2025 表C.1 贝类及产品中大肠埃希氏菌最可能数(MPN)检索表(续) 阳性管数 0.1 0.01 0.001 MPN 95%可信限下限上限阳性管数 0.1 0.01 0.001 MPN 95%可信限下限上限 4 1 3 31 10 70 5 2 1 70 22 170 4 2 0 22 6.8 50 5 2 2 94 34 230 4 2 1 26 9.8 70 5 2 3 120 36 250 4 2 2 32 10 70 5 2 4 150 58 400 4 2 3 38 14 100 5 3 0 79 22 220 4 3 0 27 9.9 70 5 3 1 110 34 250 4 3 1 33 10 70 5 3 2 140 52 400 4 3 2 39 14 100 5 3 3 180 70 400 4 4 0 34 14 100 5 3 4 210 70 400 4 4 1 40 14 100 5 4 0 130 36 400 4 4 2 47 15 120 5 4 1 170 58 400 4 5 0 41 14 100 5 4 2 220 70 440 4 5 1 48 15 120 5 4 3 280 100 710 5 0 0 23 6.8 70 5 4 4 350 100 710 5 0 1 31 10 70 5 4 5 430 150 1100 5 0 2 43 14 100 5 5 0 240 70 710 5 0 3 58 22 150 5 5 1 350 100 1100 5 1 0 33 10 100 5 5 2 540 150 1700 5 1 1 46 14 120 5 5 3 920 220 2600 5 1 2 63 22 150 5 5 4 1600 400 4600 5 1 3 84 34 220 5 5 5 >1600 700 — 5 2 0 49 15 150 注1:本表采用3个稀释度,每个稀释度接种5管,3个稀释度中每管接种的样品量分别为0.1g(mL)、0.01g (mL)、0.001g(mL)。 注2:3个稀释度中接种的样品量改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数值要相应缩小10倍;如改用 0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,则表内数值要相应扩大10倍。以此类推。 注3:必要时,本表的数值可乘以100,报告每100克(毫升)检样中大肠埃希氏菌最可能数,以MPN/100g(mL) 表示。 10 GB4789.38—2025
