中华人民共和国国家标准 GB4789.30—2025 食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验 2025-03-16发布2025-09-16实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局发布前言本标准代替GB4789.30—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》。 本标准与GB4789.30—2016相比,主要变化如下: ———修改了适用范围; ———修改了培养基和试剂,增加了OA 李斯特氏菌显色培养基配方; ———修改了第一法单核细胞增生李斯特氏菌定性检验增菌液、选择性培养基、检验程序、鉴定方法等; ———修改了第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法的样品接种、菌落计数和确认、结果计数、结果报告; ———修改了第三法单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法的样品接种。 1 GB4789.30—2025 食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验 1 范围本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的检验方法。 本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验;第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数;第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数。 2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。 2.1 冰箱:2℃~8℃。 2.2 恒温培养箱:30℃±1℃、36℃±1℃、25℃~30℃。 2.3 均质器。 2.4 显微镜:100×~1000×。 2.5 电子天平:感量为0.1g、0.1mg。 2.6 锥形瓶:100mL、500mL。 2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或移液器(量程为0.1mL、1mL、 10mL)及无菌吸头。 2.8 无菌培养皿:直径90mm。 2.9 无菌试管:16mm ×160mm。 2.10 离心机:4000r/min。 2.11 无菌离心管:30mm ×100mm。 2.12 无菌注射器:1mL。 2.13 油镜或相差显微镜。 2.14 无菌涂布棒。 2.15 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111 或CMCC54004或其他等效菌株。 2.16 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090或其他等效菌株。 2.17 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119或其他等效菌株。 2.18 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967或其他等效菌株。 2.19 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他等效菌株,要求产β-溶血环。 2.20 马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621或其他等效菌株。 2.21 小鼠:ICR品系,体重18g~22g。 1 GB4789.30—2025 2.22 微生物生化鉴定系统。 2.23 无菌过滤装置。 3 培养基和试剂 3.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):见附录A 中A.1。 3.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):见A.2。 3.3 Fraser增菌肉汤(FB1、FB2):见A.3。 3.4 OA 李斯特氏菌显色培养基:见A.4。 3.5 PALCAM 培养基:见A.5。 3.6 革兰氏染色液:见A.6。 3.7 SIM 动力培养基:见A.7。 3.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和乙酰甲基醇(VP)试验用]:见A.8。 3.9 羊血琼脂:见A.9。 3.10 无菌磷酸盐缓冲液:见A.10。 3.11 无菌生理盐水:见A.11。 3.12 糖发酵管:见A.12。 3.13 过氧化氢试剂:见A.13。 3.14 微生物生化鉴定试剂盒。 第一法单核细胞增生李斯特氏菌定性检验 4 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1。 2 GB4789.30—2025 图1 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序 5 操作步骤 5.1 增菌以无菌操作取25g(mL)样品,置于盛有225mLFB1 增菌肉汤的无菌均质杯内,8000r/min~ 10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mLFB1 增菌肉汤的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。若样品为液态,也可采用振荡或搅拌混匀。于30 ℃±1 ℃ 培养24h±2h。混匀,吸取0.1mLFB1 增菌肉汤,转种于10mLFB2 增菌肉汤内。于30℃±1℃培养24h±2h。 5.2 分离取混匀后的FB2 增菌肉汤,分别接种于OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效李斯特氏菌显色培养基)平板和PALCAM 培养基平板,36℃±1℃ 培养24h~48h,观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在OA 李斯特氏菌显色培养基平板上形成直径为1mm~3mm 的圆形蓝绿色菌落,周围有不透 3 GB4789.30—2025 明的晕圈。典型菌落在PALCAM 培养基平板上形成直径为1mm~3mm 的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈,培养48h后,部分菌落中心形成黑点且有凹陷。其他等效李斯特氏菌显色培养基平板上的菌落特征参照产品说明进行判定。 注1:一些单核细胞增生李斯特氏菌在OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈不明显甚至没有晕圈。还有一些单核细胞增生李斯特氏菌在OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈出现得比较迟缓,有时需要4d以上才出现。 注2:伊氏李斯特氏菌在OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落形态与单核细胞增生李斯特氏菌相似。 5.3 纯培养从每个平板(符合5.2要求的平板)中挑取3个~5个典型或可疑菌落(少于3个全选),在TSA-YE 平板或羊血平板上划线,于36℃±1℃培养18h~24h。单核细胞增生李斯特氏菌在TSA-YE平板或羊血平板上,呈灰白色,半透明,边缘整齐,露滴状菌落、直径为1mm~2mm。 5.4 初步鉴定挑取TSA-YE平板或羊血平板上的单个菌落,接种木糖、鼠李糖发酵管,于36℃±1℃培养24h± 2h;同时在TSA-YE平板或羊血平板上划线,于36℃±1℃培养18h~24h,以获取下一步鉴定用的纯培养物。然后选择木糖阴性,鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。 5.5 鉴定注:可先从每个平板(符合5.2要求的平板)中挑取1株菌进行鉴定试验,如果鉴定为单核细胞增生李斯特氏菌,可直接按6结果与报告的规定报告检出结果;按5.3要求挑取的3个~5个典型或可疑菌落(少于3个全选)均鉴定为非单核细胞增生李斯特氏菌后方可报告未检出的结果。 5.5.1 镜检:挑取18h~24h纯培养的单个菌落做革兰氏染色镜检,李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌, 大小为(0.4μm~0.5μm)×(0.5μm~2.0μm)。用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。 5.5.2 动力试验:挑取18h~24h纯培养的单菌落穿刺半固体或SIM 动力培养基,于25℃~30℃培养48h±2h。李斯特氏菌沿穿刺线以不规则的云雾状向四周延伸生长,培养基表面下3mm~5mm 处形成一似伞状(或梭状)界面。如伞状(或梭状)生长不明显,可继续培养,每天观察结果1次,观察 5d。 5.5.3 生化鉴定:挑取18h~24h纯培养的单个菌落,进行过氧化氢酶试验,过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验、MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。 5.5.4 溶血试验:将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格,挑取18h~24h纯培养的单个菌落刺种到血平板上,每格刺种1个菌落,并刺种阳性对照菌(单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿刺时尽量接近底部,但不要触到底面,同时避免琼脂破裂,36℃±1℃ 培养24h~48h,于明亮处观察,单核细胞增生李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、 明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭窄、微弱的溶血环,英诺克李斯特氏菌无溶血环,伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β-溶血区域。 5.5.5 协同溶血试验CAMP(可选项目):在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌,挑取18h~24h纯培养的单个菌落垂直划线接种于平行线之间,垂直线两端不要触及平行线,距离 1mm~2mm,同时接种单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌,于36℃±1℃培养24h~48h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约 2mm 的β-溶血增强区域,斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域,伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现5mm~10mm 的“箭头状”β-溶血增强区域,英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。若结果不 4 GB4789.30—2025 明显,可置2℃~8℃ 冰箱24h~48h再观察。 注:有5%~8% 的单核细胞增生李斯特氏菌可在马红球菌一端形成轻微溶血增强(约1mm)现象,此现象不属于溶血增强的情况。 表1 单核细胞增生李斯特氏菌主要鉴定特征及与其他李斯特氏菌的区别菌种木糖鼠李糖葡萄糖麦芽糖甘露醇七叶苷MR-VP 溶血试验单核细胞增生李斯特氏菌 (L.monocytogenes) - + + + - + +/+ + 格氏李斯特氏菌 (L.grayi) - - + + + + +/+ - 斯氏李斯特氏菌 (L. seeligeri) + - + + - + +/+ + 威氏李斯特氏菌 (L.welshimeri) + V + + - + +/+ - 伊氏李斯特氏菌 (L. ivanovii) + - + + - + +/+ + 英诺克李斯特氏菌 (L. innocua) - V + + - + +/+ - 部分单核细胞增生李斯特氏菌不溶血。个别单核细胞增生李斯特氏菌血清型不能发酵鼠李糖注:-表示90%~100%的菌株阴性; +表示90%~100%的菌株阳性; V表示反应不定。 如选择生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统,可不经5.4初步鉴定,直接从TSA-YE平板或羊血平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统进行鉴定。 5.6 小鼠毒力试验(可选项目) 将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中,于36℃±1℃培养24h,4000r/min离心5min, 弃上清液,用无菌生理盐水制备成浓度为1010 CFU/mL的菌悬液,取此菌悬液对3只~5只小鼠进行腹腔注射,每只0.5mL,同时观察小鼠死亡情况。小鼠于2d~5d内死亡者为致病株。试验设单核细胞增生李斯特氏菌致病株和无菌生理盐水对照组。单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。 6 结果与报告综合5.4、5.5鉴定结果,报告25g(mL)样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。25g(mL) 样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌也可报告为0/25g(mL)。 5 GB4789.30—2025 第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法 7 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序见图2。 图2 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序 8 操作步骤 8.1 样品的稀释 8.1.1 以无菌操作取25g(mL)样品,置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或无添加剂的Fraser增菌肉汤的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL上述稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。若样品为液态,也可采用振荡或搅拌混匀,制成1∶10的样品匀液。 8.1.2 用1mL无菌吸管或移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL磷酸盐缓冲液或无添加剂的Fraser增菌肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),充分混匀, 制成1∶100的样品匀液。 8.1.3 按8.1.2操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。 6 GB4789.30—2025 8.2 样品的接种 8.2.1 根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),每个稀释度分别吸取0.1mL样品匀液,接种1个OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效的李斯特氏菌显色培养基)平板。并用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如琼脂平板表面有水珠,可放在25℃~50℃的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。 注:必要时,每个稀释度可做重复试验。 8.2.2 对于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低的食品样品,吸取1mL 最低稀释度样品匀液,以 0.3mL、0.3mL、0.4mL的接种量分别涂布于3块OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效的李斯特氏菌显色培养基)平板。涂布方法同8.2.1。 8.2.3 从样品稀释至样品接种完毕不得超过45min。 8.3 培养 8.3.1 通常情况下,涂布后,将平板正置于水平桌上10min~20min后翻转平皿,放入培养箱培养, 36℃±1℃ 培养24h~48h。 8.3.2 如果样液不易吸收,可将平板正置在培养箱36 ℃±1 ℃培养1h,等样品匀液吸收后再翻转平皿,倒置于培养箱,36℃±1℃继续培养24h~48h。 8.4 典型菌落计数和确认 8.4.1 选择有典型或可疑单核细胞增生李斯特氏菌菌落生长的平板,如果: a) 只有1个稀释度的平板合计典型或可疑菌落数在15CFU~150CFU 之间,应计数该稀释度平板上的典型或可疑菌落数; b) 所有稀释度的平板合计典型或可疑菌落数均小于15CFU,应计数最低稀释度平板上的典型或可疑菌落数; c) 所有稀释度的平板合计典型或可疑菌落数大于150CFU,应计数最高稀释度平板上的典型或可疑菌落数; d) 所有稀释度的合计平板典型或可疑菌落数均不在15CFU~150CFU 之间,其中一部分小于 15CFU 或大于150CFU 时,应计数最接近15CFU 或150CFU 的稀释度平板上的典型或可疑菌落数; 符合a)~d)者按9.1.1中式(1)计算。 e) 2个连续稀释度的合计平板典型或可疑菌落数均在15CFU~150CFU 之间,按9.1.2中式(2) 计算。 8.4.2 从每个平板(符合5.2要求的平板)中挑取5个典型或可疑菌落(少于5个全选),按照5.3、5.4、 5.5进行鉴定。 9 结果与报告 9.1 计数方法 9.1.1 式(1): 7 GB4789.30—2025 T = AB CVd…………………………(1) 式中: T ———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数[CFU/g(mL)]; A ———计数稀释度典型或可疑菌落的总数; B ———计数稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数; C ———计数稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数; V ———计数稀释度的接种量,以毫升(mL)计; d ———稀释因子。 9.1.2 式(2): T = A1B1/C1 +A2B2/C2 Vd…………………………(2) 式中: T ———样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数[CFU/g(mL)]; A1 ———第一计数稀释度(低稀释倍数)单核细胞增生李斯特氏菌典型或可疑菌落的总数; A2 ———第二计数稀释度(高稀释倍数)单核细胞增生李斯特氏菌典型或可疑菌落的总数; B1 ———第一计数稀释度(低稀释倍数)鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数; B2 ———第二计数稀释度(高稀释倍数)鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数; C1 ———第一计数稀释度(低稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数; C2 ———第二计数稀释度(高稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数; V ———第一计数稀释度接种量加第二计数稀释度1/10接种量,以毫升(mL)计,如:接种量采用 0.1mL 方法的V 值为0.11;接种量采用0.3mL、0.3mL、0.4mL方法的V 值为1.1; d ———稀释因子(第一个稀释度)。 9.2 结果报告 9.2.1 菌落数小于100CFU 时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。 9.2.2 菌落数大于或等于100CFU 时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前两位数字,后面用 0代替位数。也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,保留两位有效数字。 9.2.3 报告每g(mL)样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数,以CFU/g(mL)表示;如T 值为0,接种量采用0.1mL方法的以小于10乘以最低稀释倍数报告。接种量采用0.3mL、0.3mL、0.4mL方法的以小于1乘以最低稀释倍数报告。 第三法单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法 10 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法检验程序见图3。 8 GB4789.30—2025 图3 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法检验程序 11 操作步骤 11.1 样品的稀释样品稀释液用磷酸盐缓冲液。样品稀释方法同8.1。 11.2 接种和培养 11.2.1 根据对样品污染状况的估计,选取3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),接种于10mLFB1 增菌肉汤,每一稀释度接种3管,每管接种1mL。如果接种量为10mL,接种至10mL 双料FB1 增菌肉汤。于30℃±1℃培养24h±2h。每管各吸取0.1mL,转种于10mLFB2 增菌肉汤内,于30℃±1℃培养24h±2h。 11.2.2 用接种环分别从FB2 增菌肉汤各管中移取1环,接种OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效的李斯特氏菌显色培养基)平板,36℃±1℃培养24h~48h。 11.3 确证试验从每个平板(符合5.2要求的平板)中挑取3个~5个典型或可疑菌落(少于3个全选),按照5.3、 5.4、5.5进行鉴定。 12 结果与报告根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数,查MPN 检索表(见附录B),报告每克(毫升)样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数,以MPN/g(mL)表示。 9 GB4789.30—2025 附录 A 培养基和试剂 A.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE) A.1.1 成分胰蛋白胨(胰酪胨) 17.0g 多价胨3.0g 酵母膏粉6.0g 氯化钠5.0g 磷酸氢二钾2.5g 葡萄糖2.5g 蒸馏水1000mL A.1.2 制法将上述各成分加热搅拌溶解,必要时调节pH,分装,121℃高压灭菌15min,备用。培养基灭菌后 25℃的pH 为7.2±0.2。 A.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE) A.2.1 成分胰蛋白胨(胰酪胨) 17.0g 多价胨3.0g 酵母膏粉6.0g 氯化钠5.0g 磷酸氢二钾2.5g 葡萄糖2.5g 琼脂15.0g 蒸馏水1000mL A.2.2 制法将上述各成分加热搅拌溶解,必要时调节pH 至7.2±0.2,分装,121 ℃高压灭菌15min,冷却至 47℃~50℃,倾倒在无菌的平皿中,备用。培养基灭菌后25℃的pH 为7.2±0.2。 A.3 Fraser增菌肉汤(FB1、FB2) A.3.1 基础培养基 A.3.1.1 成分胰蛋白胨(胰酪胨) 5.0g 牛肉膏粉5.0g 酵母膏粉5.0g 蛋白胨5.0g 10 GB4789.30—2025 氯化钠20.0g 磷酸二氢钾1.35g 磷酸氢二钠12.0g 氯化锂3.0g 七叶苷1.0g 蒸馏水1000mL A.3.1.2 制法将上述各成分加热搅拌溶解,必要时调节pH,分装,121℃高压灭菌15min,冷却至47℃~50℃。 培养基灭菌后25℃的pH 为7.2±0.2。 A.3.2 添加剂 A.3.2.1 1%萘啶酮酸溶液将0.5g萘啶酮酸钠盐溶于50mL0.05mol/L氢氧化钠中,并通过0.45μm 无菌滤膜过滤除菌。 A.3.2.2 0.25%盐酸吖啶黄溶液将0.25g盐酸吖啶黄溶于100mL蒸馏水中,用0.45μm 的无菌滤膜过滤除菌。 A.3.2.3 5%柠檬酸铁铵溶液将5g柠檬酸铁铵溶于100mL蒸馏水中,用0.45μm 的无菌滤膜过滤除菌。 A.3.3 完全培养基 A.3.3.1 FB1 增菌肉汤基础培养基(A.3.1) 984mL 1%萘啶酮酸溶液(A.3.2.1) 1mL 0.25%盐酸吖啶黄溶液(A.3.2.2) 5mL 5%柠檬酸铁铵溶液(A.3.2.3) 10mL A.3.3.2 FB2 增菌肉汤基础培养基(A.3.1) 978mL 1%萘啶酮酸溶液(A.3.2.1) 2mL 0.25%盐酸吖啶黄溶液(A.3.2.2) 10mL 5%柠檬酸铁铵溶液(A.3.2.3) 10mL A.4 OA 李斯特氏菌显色培养基(AgarListeriaaccordingtoOttavianiandAgosti) A.4.1 基础培养基 A.4.1.1 成分蛋白胨 18.0g 胰蛋白胨(胰酪胨) 6.0g 酵母膏粉10.0g 丙酮酸钠2.0g 葡萄糖2.0g 11 GB4789.30—2025 甘油磷酸镁1.0g 硫酸镁(无水) 0.5g 氯化钠5.0g 氯化锂10.0g 磷酸氢二钠(无水) 2.5g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃葡萄糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranoside) 0.05g 琼脂15.0g 蒸馏水930mL* 注:* 表示如果用两性霉素B替代环己酰亚胺,基础培养基配制体积改为925mL。 A.4.1.2 制法将上述各成分加热搅拌溶解,必要时调节pH,分装,121℃高压灭菌15min,冷却至47℃~50℃。 培养基灭菌后25℃的pH 为7.2±0.2。 A.4.2 添加剂 A.4.2.1 0.4%萘啶酮酸溶液将0.02g萘啶酮酸钠盐溶于5mL氢氧化钠中,并通过0.45μm 无菌滤膜过滤除菌。 A.4.2.2 0.4%头孢他啶溶液将0.02g头孢他啶溶于5mL蒸馏水中,用0.45μm 的无菌滤膜过滤除菌。 A.4.2.3 多黏菌素B溶液将76700IU 硫酸多黏菌素B溶于5mL蒸馏水中,用0.45μm 的无菌滤膜过滤除菌。 A.4.2.4 2%环己酰亚胺溶液将0.05g环己酰亚胺溶于2.5mL无水乙醇中,然后加蒸馏水2.5mL,用0.45μm 的无菌滤膜过滤除菌。 A.4.2.5 0.1%两性霉素B溶液(作为环己酰亚胺溶液的替代品) 将2.5mL盐酸(1mol/L)和7.5mL二甲基甲酰胺(DMF)混合成HCl/DMF溶液,加0.01g两性霉素溶解后,用0.45μm 的无菌滤膜过滤除菌。 A.4.2.6 L-α-磷脂酰肌醇溶液将2g的L-α-磷脂酰肌醇溶于50mL的蒸馏水中(可以使用2g含有9%~15%的未分级磷脂酰肌醇的大豆卵磷脂代替L-α-磷脂酰肌醇),搅拌约30min直至获得均匀的悬浮液。在121℃下高压灭菌 15min,然后冷却至47℃~50℃。 A.4.3 完全培养基 A.4.3.1 成分基础培养基(A.4.1) 930mL 0.4%萘啶酮酸溶液(A.4.2.1) 5mL 0.4%头孢他啶溶液(A.4.2.2) 5mL 12 GB4789.30—2025 多黏菌素B溶液(A.4.2.3) 5mL 2%环己酰亚胺溶液(A.4.2.4) 5mL 或0.1%两性霉素B溶液(A.4.2.5) 10mL L-α-磷脂酰肌醇溶液(A.4.2.6) 50mL 在基础培养基(A.4.1)冷却至47℃~50℃时,依次加入萘啶酮酸、头孢他啶、多黏菌素B、环己酰亚胺或两性霉素B、L-α-磷脂酰肌醇溶液。每次添加均需要立即充分混合均匀。完全培养基的pH 在 25℃ 下应为7.2±0.2,介质应均匀呈轻微乳白色。混匀后倾倒在无菌的平皿中,每个培养皿中倒入 18mL~20mL,凝固后备用。 A.5 PALCAM 培养基 A.5.1 成分酵母膏粉8.0g 葡萄糖0.5g 七叶苷0.8g 柠檬酸铁铵0.5g 甘露醇10.0g 酚红0.1g 氯化锂15.0g 酪蛋白胰酶消化物(酪蛋白胨) 10.0g 心胰酶消化物3.0g 玉米淀粉1.0g 肉胃酶消化物5.0g 氯化钠5.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000mL A.5.2 制法将上述各成分加热搅拌溶解,必要时调节pH,分装,121℃高压灭菌15min。培养基灭菌后25℃ 的pH 为7.2±0.2。 A.5.2.1 PALCAM 选择性添加剂多黏菌素B 10.0mg 盐酸吖啶黄5.0mg 头孢他啶20.0mg 无菌蒸馏水2mL A.5.2.2 制法将PALCAM 基础培养基冷却至47℃~50℃,加入2mLPALCAM 选择性添加剂,混匀后倾倒在无菌的平皿中,每个培养皿中倒入18mL~20mL,凝固后备用。 13 GB4789.30—2025 A.6 革兰氏染色液 A.6.1 结晶紫染色液 A.6.1.1 成分结晶紫1.0g 95% 乙醇20.0mL 1% 草酸铵水溶液80.0mL A.6.1.2 制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵水溶液混合。 A.6.2 革兰氏碘液 A.6.2.1 成分碘1.0g 碘化钾2.0g 蒸馏水300mL A.6.2.2 制法将碘与碘化钾先进行混合,加入少许蒸馏水,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。 A.6.3 沙黄复染液 A.6.3.1 成分沙黄0.25g 95%乙醇10.0mL 蒸馏水90.0mL A.6.3.2 制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。 A.6.4 染色法 A.6.4.1 涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液,作用1min,水洗。 A.6.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。 A.6.4.3 滴加95%乙醇脱色15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。 A.6.4.4 滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。 A.7 SIM 动力培养基 A.7.1 成分胰蛋白胨(胰酪胨) 20.0g 多价胨6.0g 硫酸铁铵0.2g 14 GB4789.30—2025 硫代硫酸钠0.2g 琼脂3.5g 蒸馏水1000mL A.7.2 制法将上述各成分加热搅拌溶解,必要时调节pH,分装小试管,121 ℃高压灭菌15min,备用。培养基灭菌后25℃的pH 为7.2±0.2。 A.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和乙酰甲基醇(VP)试验用] A.8.1 成分多价胨7.0g 葡萄糖5.0g 磷酸氢二钾5.0g 蒸馏水1000mL A.8.2 制法将上述各成分加热搅拌溶解,必要时调节pH,分装试管,每管1mL。121 ℃高压灭菌15min,备用。缓冲葡萄糖蛋白胨水灭菌后25℃的pH 为7.2±0.2。 A.8.3 甲基红(MR)试验 A.8.3.1 甲基红试剂 A.8.3.1.1 成分甲基红10mg 95% 乙醇30mL 蒸馏水20mL A.8.3.1.2 制法 10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中,然后加入20mL蒸馏水。 A.8.3.1.3 试验方法取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36 ℃±1 ℃培养2d~5d。滴加甲基红试剂 1滴,立即观察结果。鲜红色为阳性,黄色为阴性。 A.8.4 乙酰甲基甲醇(VP)试验 A.8.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液成分及制法:取α-萘酚6.0g,加无水乙醇溶解,定容至100mL。 A.8.4.2 40%氢氧化钾溶液成分及制法:取氢氧化钾40g,加蒸馏水溶解,定容至100mL。 15 GB4789.30—2025 A.8.4.3 试验方法取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36℃±1℃培养2d~4d,加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL,充分振摇试管,观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色,如为阴性,应放在36℃±1℃ 继续培养1h再进行观察。 A.9 羊血琼脂 A.9.1 成分蛋白胨1.0g 牛肉膏0.3g 氯化钠0.5g 琼脂1.5g 蒸馏水100mL 脱纤维羊血5mL~8mL A.9.2 制法除新鲜脱纤维羊血外,加热溶化上述各组分,121℃高压灭菌15min,冷至50℃,以无菌操作加入新鲜脱纤维羊血,摇匀,倾注平板。 A.10 无菌磷酸盐缓冲液 A.10.1 储存液成分磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g 1mol/L氢氧化钠约175mL 蒸馏水1000mL A.10.2 制法 A.10.2.1 1mol/L氢氧化钠:称取20.0g的氢氧化钠溶于500mL蒸馏水中。 A.10.2.2 储存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH 至7.2,用蒸馏水定容至1000mL后储存于冰箱。 A.10.2.3 工作液:取储存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃ 高压灭菌 15min。 A.11 无菌生理盐水 A.11.1 成分氯化钠8.5g 蒸馏水1000mL A.11.2 制法称取8.5g的氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min。 16 GB4789.30—2025 A.12 糖发酵管 A.12.1 糖发酵基础肉汤牛肉膏5.0g 蛋白胨10.0g 氯化钠3.0g 十二水磷酸氢二钠(Na2 HPO4·12H2O) 2.0g 0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0mL 蒸馏水1000mL A.12.2 制法 A.12.2.1 将上述各成分加热搅拌溶解,必要时调节pH,分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min,备用。糖发酵基础肉汤灭菌后25℃的pH 为7.4±0.2。 A.12.2.2 葡萄糖发酵管:用蒸馏水将葡萄糖配制??-10%溶液,121 ℃高压灭菌15min。无菌吸取5 mL葡萄糖溶液加入按A.12.2.1配制的100mL糖发酵基础肉汤内,混匀后,以无菌操作分装于小试管中,备用。葡萄糖发酵管25℃的pH 为7.4±0.2。 A.12.2.3 其他各种糖发酵管:可按照A.12.2.2葡萄糖发酵管的配制方法制备其他糖类发酵管。 A.12.3 试验方法取适量纯培养物接种于糖发酵管,36 ℃±1 ℃培养24h~48h,观察结果,蓝色为阴性,黄色为阳性。 A.13 过氧化氢试剂 A.13.1 试剂 3%过氧化氢溶液,临用配制。 A.13.2 过氧化氢酶试验方法用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落,置于洁净玻璃平皿内,滴加3%过氧化氢溶液2滴,观察结果。 A.13.3 结果于0.5min内发生气泡者为阳性,不发生气泡者为阴性。 17 GB4789.30—2025 附录 B 单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN)表每克(毫升)检样中单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN)的检索见表B.1。 表B.1 单核细胞增生李斯特氏菌最可能数(MPN)检索表阳性管数 0.10 0.01 0.001 MPN 95%置信区间下限上限阳性管数 0.10 0.01 0.001 MPN 95%置信区间下限上限 0 0 0 <3.0 — 9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 — 注1:本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)],每个稀释度接种3管。 注2:表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g (mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL),则表内数字应相应增高10倍,其余类推。 18 GB4789.30—2025
