中华人民共和国国家标准 GB4789.3—2025 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数 2025-03-16发布2025-09-16实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局发布前言本标准代替GB4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。 本标准与GB4789.3—2016相比,主要变化如下: ———删除了检验原理; ———修改了术语和定义; ———修改了设备和材料、培养基和试剂; ———修改了检验程序、操作步骤、结果与报告和附录。 1 GB4789.3—2025 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数 1 范围本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。 本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数,第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。 2 术语和定义 2.1 大肠菌群 coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 2.2 MPN 法 mostprobablenumber(MPN)technique 统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最可能数。 3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。 3.1 恒温培养箱:36℃±1℃、30℃±1℃。 3.2 冰箱:2℃~8℃。 3.3 恒温装置:48℃±2℃。 3.4 天平:感量0.1g。 3.5 均质器及无菌均质袋、均质杯,振荡器。 3.6 试管:15mm×150mm、18mm×180mm 或其他合适规格,以及小倒管(杜氏管)或其他合适的产气收集装置。 3.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、2mL(具0.02mL刻度)、5mL(具0.05mL刻度)、10mL(具 0.1mL 刻度)或微量移液器及无菌吸头。 3.8 无菌锥形瓶:容量500mL。 3.9 无菌培养皿:直径90mm。 3.10 pH 计或精密pH 试纸。 3.11 无菌接种环:10μL(直径约3mm)。 3.12 放大镜或菌落计数器。 4 培养基和试剂 4.1 磷酸盐缓冲液:见附录A 中A.1。 4.2 生理盐水:见A.2。 1 GB4789.3—2025 4.3 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤:见A.3。 4.4 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤:见A.4。 4.5 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA):见A.5。 4.6 1mol/LNaOH:见A.6。 4.7 1mol/LHCl:见A.7。 4.8 大肠菌群计数测试片(应以发酵乳糖产酸产气为阳性结果判断依据,且性能符合GB4789.28中相关培养基的质量要求)。 第一法大肠菌群MPN 计数法 5 检验程序大肠菌群MPN 计数法的检验程序见图1。 图1 大肠菌群MPN 计数法检验程序 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品:无菌操作称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min;或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。 2 GB4789.3—2025 6.1.2 液体样品:用无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中充分混匀,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。当样品不适宜进行体积取样时,按6.1.1操作。 6.1.3 必要时用1mol/LNaOH 或1mol/L HCl,调节样品匀液或液体样品原液的pH 至6.5~7.5 之间。 6.1.4 用无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入装有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),将试管在振荡器上振荡混匀,制成 1∶100的样品匀液。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计,参照6.1.4的操作,依次制??-10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支无菌吸管或吸头。 6.2 初发酵试验每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管 LST肉汤,每管LST肉汤接种1mL样品匀液(如接种体积超过1mL,则加到等体积的双料LST肉汤中)。从制备样品匀液开始至接种到LST肉汤完毕,全过程不得超过15min。将已接种样品的LST肉汤管置于36℃±1℃培养24h±2h,检查产气情况。小倒管或产气收集装置内有气泡产生,或轻轻振摇LST肉汤管可见试管内有细密气泡不断上升者,判断为产气,产气者进行复发酵试验(确认试验)。 如未产气则继续培养至48h±2h再检查产气情况,产气者进行复发酵试验;培养至48h±2h,仍未产气者判断为大肠菌群阴性。若培养至48h±2h,所有LST肉汤管均未产气,按照附录B中的MPN 检索表,报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN 值,以MPN/g(mL)表示。 6.3 复发酵试验(确认试验) 轻轻振摇各产气的LST肉汤管,分别用接种环取培养物1环,转种于BGLB肉汤管中,36℃±1℃ 培养24h±2h,检查产气情况,产气者判断为大肠菌群阳性;未产气者则继续培养至48h±2h再检查产气情况,产气者判断为大肠菌群阳性,仍未产气者判断为大肠菌群阴性。 7 结果与报告根据复发酵试验中3个适宜连续稀释度中大肠菌群阳性的管数(如连续的稀释度超过3个,根据附录C确定最适的3个连续稀释度),按照附录B中的MPN 检索表,报告每克(毫升)样品中大肠菌群的 MPN 值,以MPN/g(mL)表示。 第二法大肠菌群平板计数法 8 检验程序大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。 3 GB4789.3—2025 图2 大肠菌群平板计数法检验程序 9 操作步骤 9.1 样品的稀释按6.1进行。 9.2 接种与培养 9.2.1 根据对样品污染状况的估计,选取2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌培养皿,每皿1mL。同时取磷酸盐缓冲液或生理盐水加入2个无菌培养皿作空白对照,每皿1mL。 9.2.2 尽快将冷却至48℃±2℃的VRBA 倾注于培养皿中,每皿15mL~20mL。小心旋转培养皿, 将培养基与接种的样品匀液充分混匀,水平静置待其凝固。从制备样品匀液开始至倾注VRBA 完毕, 全过程不得超过15min。琼脂凝固后,再均匀覆盖3mL~4mLVRBA 至整个平板表面。覆层的琼脂凝固后翻转平板,置于36℃ ±1℃培养18h~24h。对于乳及乳制品,应置于30℃±1℃培养18h~ 24h。 9.2.3 若采用大肠菌群计数测试片,则按其说明进行操作。 9.3 平板菌落数的选择 9.3.1 观察并计数菌落,必要时用放大镜或菌落计数器。选取所有菌落数在15CFU~150CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为红色至紫红色,菌落周围可带有红色沉淀环,菌落直径一般大于0.5mm。可疑菌落为红色至紫红色,菌落直径一般小于0.5mm。 9.3.2 若有2个稀释度的平板菌落数在15CFU~150CFU 之间以及其他情形的菌落数选择,按附录 D的规定执行。 9.4 确认试验从同一稀释度的VRBA 平板上挑取典型和可疑菌落各5个,典型或可疑菌落少于5个者,则挑取其全部菌落。每个菌落接种1支BGLB肉汤管,36℃±1℃培养24h±2h,检查产气情况,产气者为大 4 GB4789.3—2025 肠菌群阳性;未产气者则继续培养至48h±2h再观察,产气者为大肠菌群阳性,仍未产气者为大肠菌群阴性。 10 结果与报告 10.1 所选稀释度的典型菌落数以及可疑菌落数与各自大肠菌群阳性率的乘积之和的平均值,乘以稀释倍数,为大肠菌群的菌落数。大肠菌群的菌落数小于100CFU 时,按“四舍五入”的原则修约,以整数报告。大肠菌群的菌落数大于或等于100CFU 时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,保留两位有效数字。 附录D规定了大肠菌群菌落数的计算、数值修约和结果报告的方式,并给出了相关示例。 10.2 若空白对照上有菌落生长,则此次检验结果无效。 10.3 称重取样以CFU/g为单位报告结果,体积取样以CFU/mL为单位报告结果。 5 GB4789.3—2025 附录 A 培养基和试剂 A.1 磷酸盐缓冲液 A.1.1 成分磷酸二氢钾 34.0g 蒸馏水 500mL A.1.2 制法贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水(或其他符合要求的实验用水,下同)中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH 至7.2±0.2,用蒸馏水稀释至1000mL,密封贮存于冰箱。工作液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1000 mL,分装于适宜容器中,121 ℃ 高压灭菌 15min,用作样品稀释。 A.2 生理盐水 A.2.1 成分氯化钠 8.5g 蒸馏水 1000mL A.2.2 制法将氯化钠在蒸馏水中溶解,121℃高压灭菌15min。 A.3 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤 A.3.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨 20.0g 氯化钠 5.0g 乳糖 5.0g 磷酸氢二钾 2.75g 磷酸二氢钾 2.75g 月桂基硫酸钠 0.1g 蒸馏水 1000mL A.3.2 制法将各成分(双料LST肉汤除蒸馏水外,其他各成分的用量加倍)加入蒸馏水中加热溶解,必要时调节pH。分装至有小倒管的试管中,每管10mL。121 ℃高压灭菌15min,灭菌后培养基在25 ℃时的 pH 为6.8±0.2。 6 GB4789.3—2025 A.4 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤 A.4.1 成分蛋白胨 1 0.0g 乳糖 1 0.0g 牛胆粉 2 0.0g 煌绿 0 .0133g 蒸馏水 1 000mL A.4.2 制法将各成分在蒸馏水中加热溶解,必要时调节pH。分装至有小倒管的试管中,每管10mL。121 ℃ 高压灭菌15min,灭菌后培养基在25℃时的pH 为7.2±0.2。 A.5 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA) A.5.1 成分蛋白胨 7 .0g 酵母浸粉 3 .0g 乳糖 1 0.0g 氯化钠 5 .0g 胆盐或3号胆盐 1 .5g 中性红 0 .03g 结晶紫 0 .002g 琼脂 1 5.0g~18.0g 蒸馏水 1 000mL A.5.2 制法将各成分加入蒸馏水中,边搅拌边加热至完全溶解,必要时调节pH。煮沸杀菌,煮沸时长不超过 2min。培养基宜在24h内倾注平板。煮沸后培养基在25℃时的pH 为7.4±0.2。 A.6 1mol/LNaOH A.6.1 成分氢氧化钠 4 0.0g 蒸馏水 1 000mL A.6.2 制法称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中。 A.7 1mol/LHCl A.7.1 成分浓盐酸 8 9mL 7 GB4789.3—2025 蒸馏水 1 000mL A.7.2 制法量取浓盐酸89mL,用蒸馏水稀释至1000mL。 8 GB4789.3—2025 附录 B 大肠菌群最可能数(MPN)检索表每克(毫升)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表B.1。 表B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表阳性管数 0.1 0.01 0.001 MPN 95%可信限下限上限阳性管数 0.1 0.01 0.001 MPN 95%可信限下限上限 0 0 0 <3.0 — 9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 — 注1:本表采用3个稀释度,每个稀释度接种3管,3个稀释度中每管接种的样品量分别为0.1g(mL)、0.01g (mL)、0.001g(mL)。 注2:3个稀释度中接种的样品量若改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数值要相应缩小10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,表内数值要相应扩大10倍。以此类推。 注3:必要时,本表的数值可乘以100,报告每100克(毫升)检样中大肠菌群最可能数(MPN),以MPN/100g (mL)表示。 9 GB4789.3—2025 附录 C 确定最适的3个连续稀释度方法以10-1~10-55个连续稀释度的MPN 计数法为例,按如下方法确定其中最适的3个连续稀释度, 示例见表C.1。 C.1 有1个及以上的稀释度3管均为阳性选择3管都是阳性结果的最高稀释度及其相连的2个更高稀释度(见表C.1示例a、b);在未选择的较高稀释度中还有阳性结果时,则顺次移到下一更高的3个连续稀释度(见表C.1示例c),如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果,则将此阳性结果加到选择的最高稀释度,进而确定3个连续稀释度(见表C .1示例d);如果不能按照本规则找到3个合适的稀释度,则从前一个较低的稀释度开始,选择3个连续稀释度(见表C.1示例e)。 C.2 没有任何1个稀释度3管均为阳性选择3个最低稀释度(见表C.1示例f);如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果,将阳性结果都加到选择的最高稀释度,进而确定3个连续稀释度(见表C.1示例g)。 表C.1 确定最适的3个连续稀释度方法示例示例编号接种的样品量/g(mL) 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001 选择的3个连续稀释度的阳性管数MPN/g(mL) a 3 3 1 0 0 x310x 430 b 2 3 1 0 0 x310x 430 c 3 2 2 1 0 x221x 280 d 3 2 2 1 1 x222x 350 e 3 3 3 3 2 xx332 110000 f 0 1 0 0 0 010xx 3.0 g 2 2 0 1 1 222xx 35 10 GB4789.3—2025 附录 D 大肠菌群平板计数结果处理及示例以固体样品为例,对大肠菌群平板计数菌落数的选择、确认、大肠菌群菌落数的结果计算与结果报告示例如下。 D.1 只有1个稀释度的平板菌落数在计数范围内,计数结果处理示例见表D.1。 表D.1 大肠菌群平板计数结果处理示例(一) 稀释度1∶10 1∶100 平板上所有菌落数80 68 8 6 平板上典型菌落数60 55 — — 平板上可疑菌落数18 10 — — 待确认菌落形态分类典型菌落可疑菌落典型菌落可疑菌落待确认菌落分类合计115 28 — — 阳性比(阳性数/确认试验的菌落数) 4/5 3/5 — — 选择菌落数在计数范围内同一稀释度的两块平板,对其典型菌落和可疑菌落分别进行计数,随机选取两块平板上的典型菌落和可疑菌落各5个进行确认试验。用典型菌落数与其阳性比的乘积,加上可疑菌落数与其阳性比的乘积后,取平均值再乘以稀释倍数,按“四舍五入”的原则修约后报告结果。结果计算与结果报告示例如下: 结果计算: 115×45 +28×35 ×10 2 =544 结果报告:540CFU/g或5.4×102 CFU/g。 D.2 有两个连续稀释度的平板菌落数在计数范围内,其中次低稀释度只有1个平板的菌落数在计数范围内,计数结果处理示例见表D.2。 表D.2 大肠菌群平板计数结果处理示例(二) 稀释度1∶100 1∶1000 平板上所有菌落数110 103 16 8 平板上典型菌落数54 50 7 — 平板上可疑菌落数55 51 9 — 待确认菌落形态分类典型菌落可疑菌落典型菌落可疑菌落待确认菌落分类合计104 106 7 9 阳性比(阳性数/确认试验的菌落数) 4/5 2/5 3/5 2/5 对菌落数在计数范围内每个稀释度的平板上的典型菌落和可疑菌落分别进行计数,随机选取每个稀释度上的典型菌落和可疑菌落各5个进行确认试验。用所选平板上大肠菌群菌落数之和,除以所选平板中接种的样品量之和,按“四舍五入”的原则修约后报告结果。结果计算与结果报告示例如下: 11 GB4789.3—2025 结果计算: 104×45 +106×25 +7×35 +9×25 0.01×2+0.001×1 =6352.4 结果报告:6400CFU/g或6.4×103 CFU/g。 D.3 最低稀释度的平板菌落数低于计数范围,计数结果处理示例见表D.3。 对最低稀释度两块平板上的典型菌落和可疑菌落分别进行计数,随机选取典型菌落和可疑菌落各 5个(不足5个时选取全部菌落)进行确认试验。用典型菌落数与其阳性比的乘积,加上可疑菌落数与其阳性比的乘积后,取平均值再乘以稀释倍数,按“四舍五入”的原则修约后报告结果。结果计算与结果报告示例如下: 表D.3 大肠菌群平板计数结果处理示例(三) 稀释度1∶10 1∶100 平板上所有菌落数6 3 0 0 平板上典型菌落数3 1 — — 平板上可疑菌落数3 2 — — 待确认菌落形态分类典型菌落可疑菌落典型菌落可疑菌落待确认菌落分类合计4 5 — — 阳性比(阳性数/确认试验的菌落数) 3/4 2/5 — — 结果计算: 4×34 +5×25 ×10 2 =25 结果报告:25CFU/g。 D.4 最低稀释度的平板菌落数高于计数范围,次低稀释度的平板菌落数低于计数范围,计数结果处理示例见表D.4。 表D.4 大肠菌群平板计数结果处理示例(四) 稀释度1∶10 1∶100 平板上所有菌落数158 156 13 12 平板上典型菌落数43 40 — — 平板上可疑菌落数112 114 — — 待确认菌落形态分类典型菌落可疑菌落典型菌落可疑菌落待确认菌落分类合计83 226 — — 阳性比(阳性数/确认试验的菌落数) 5/5 2/5 — — 选择菌落平均数最接近15CFU 或150CFU 的稀释度,对该稀释度典型菌落和可疑菌落分别进行计数,随机选取典型菌落和可疑菌落各5个进行确认试验。用典型菌落数与其阳性比的乘积,加上可疑菌落数与其阳性比的乘积后,取平均值再乘以稀释倍数,按“四舍五入”的原则修约后报告结果。结果计算与结果报告示例如下: 结果计算: 83×55 +226×25 ×10 2 =867 12 GB4789.3—2025 结果报告:870CFU/g或8.7×102 CFU/g。 D.5 若所有稀释度的平板上均无典型或可疑菌落生长,结果以小于1乘以最低稀释倍数计算。计数结果处理示例见表D.5。 表D.5 大肠菌群平板计数结果处理示例(五) 稀释度1∶10 1∶100 平板上所有菌落数0 0 0 0 平板上典型菌落数0 0 — — 平板上可疑菌落数0 0 — — 待确认菌落形态分类典型菌落可疑菌落典型菌落可疑菌落待确认菌落分类合计— — — — 阳性比(阳性数/确认试验的菌落数) — — — — 结果报告:<10CFU/g。 D.6 所选稀释度的平板菌落数在计数范围内,但确认试验均无大肠菌群阳性,结果以小于1乘以所选稀释度中较低的稀释倍数计算。计数结果处理示例见表D.6。 表D.6 大肠菌群平板计数结果处理示例(六) 稀释度1∶10 1∶100 平板上所有菌落数142 136 17 18 平板上典型菌落数0 0 0 0 平板上可疑菌落数140 134 17 18 待确认菌落形态分类典型菌落可疑菌落典型菌落可疑菌落待确认菌落分类合计0 274 0 35 阳性比(阳性数/确认试验的菌落数) — 0/5 — 0/5 结果报告:<10CFU/g。 13 GB4789.3—2025
