ICS CCS
67.040 X80
QB
中华人民共和国轻工行业标准
QB/T8155-2025
大麦苗粉制品中大麦源性成分检测 PCR 法
Identification of barley-derived components in barley grass powder products —PCR method
2025-07-02发布 2026-02-01实施
中华人民共和国工业和信息化部发布
QB/T8155-2025
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中国轻工业联合会提出。
本文件由全国食品工业标准化技术委员会工业发酵分技术委员会(SAC/TC64/SC 5) 归口。
本文件起草单位：杭州博可生物科技股份有限公司、中国食品发酵工业研究院有限公司、安徽国泰众信检测技术有限公司、国家食品安全风险评估中心、广州汇标检测技术中心、浙江公正检验中心有限公司、天津科技大学、河北工程大学。
本文件主要起草人：曾军英、张媛媛、陈洪周、李燕俊、仇凯、杨群华、洪敏、牛邦彦、杜欣军、 常世敏、曹品品、东思源。
本文件为首次发布。
工
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大麦苗粉制品中大麦源性成分检测 PCR 法
1 范围
本文件描述了采用PCR 法检测大麦苗粉制品中大麦源性成分的方法，包括第一法特异性PCR法、第二法实时荧光PCR法。
本文件适用于以大麦嫩苗为原料，经预处理，采用提取或干燥粉碎等不同加工工艺而得到的大麦苗粉制品中大麦源性成分定性检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp: 碱基对 ( base pair)
Ct: 阈值循环数( cycle threshold)
DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dATP: 脱氧腺苷三磷酸 ( deoxy-adenosine triphosphate)
dCTP: 脱氧胞苷三磷酸( deoxy-cytidine triphosphate)
dGTP: 脱氧鸟苷三磷酸 ( deoxy-guanosine triphosphate)
dNTPs: 脱氧核糖核苷酸( deoxy-ribonucleoside triphosphate)
dTTP: 脱氧胸苷三磷酸( deoxy-thymidine triphosphate)
EDTA: 乙二胺四乙酸 ( ethylene diamine tetraacetic acid)
FAM: 6-羧基荧光素(6- carboxyfluorescein)
PCR: 聚合酶链式反应( polymerase chain reaction)
TAMRA: 6-羧基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethylrhodamine)
Taq: 水生栖热菌 ( thermus aquaticus)
Tris: 三(羟甲基)氨基甲烷 ( tris(hydroxymethyl)aminomethane)
UNG: 尿嘧啶-N- 糖基化( uracil-N-glycosylase)
18S rRNA:18S 核糖体RNA(18S ribosomal acid RNA)
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5 防止污染措施
防止污染措施应遵守GB/T27403-2008 中附录D的规定
6 第一法特异性PCR 法
6.1 原理
以提取的大麦苗粉制品样品中的总DNA为模板，设计大麦源性成分的特异性引物进行PCR扩增， 以琼脂糖凝胶电泳检测是否出现预期目标片段，再利月限制性内切酶床应或测序进行确证，从而判定样品中是否含有大麦源性成分。
6.2 试剂和材料
除另有说明外，试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水为GB/T 6682-2008规定的一级水。
6.2.1 dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP|
6.2.2 10×PCR 缓冲液。
6.2.3 Taq DNA 聚合酶。
6.2.4 冰乙酸。
6.2.5 氢氧化钠。
6.2.6 溴代十六烷基三甲基铵(CTAB)。
6.2.7 三氯甲烷。
6.2.8 异丙醇。
6.2.9 琼脂糖。
6.2.10 溴化乙锭或其他可代替的染料。
6.2.116×loading buffer( 上样液)。
6.2.12 DNA分子量标记：100 bp。
6.2.13 TE 缓冲液：800mL水中，依次加入1 mo/L Tris-HCI溶液10 mL和0.5 mo/LEDTA 溶液 2 mL, 用水定容至1L, 混匀，121℃灭菌15min, 备用。
6.2.141×TAE 缓中液：称取242g Tns和37.2 g 的 Na₂EDTA·21₂O 放入烧杯中加入约800 mL水， 充分搅拌，然后加入57.1mL 冰乙酸，/用水定容至1L, 混匀，配制??-50×TAE 缓冲液，室温保存，使
用时用水稀释为1×TAE缓冲液。
6.2.15 2%琼脂糖凝胶：称取0.8g 琼脂糖于锥形瓶中，加入40.0mL1×TAE 缓冲液，加热溶解。
6.2.161 mol/L Tri HCI溶液：称取60.55g Tris-base 溶于适量水中，加1 mol/LHCI 调 pH 至8.0,定容至500 mL, 混匀，121℃灭菌15 min, 备用。
6.2.170.5mol/L EDTA 溶液：称取186.1 g Na₂EDTA·2H₂O 溶于800mL 水中，用 1 mol/L NaOH 调 pH 至8.0,定容至1000mL, 混匀，121°℃灭菌15min, 备用。
6.2.185 mol/L NaCl 溶液：称取292.5 g NaCl浴于适量水中，定容至1000 mL, 混匀，121℃灭菌 15min, 备用。
6.2.19 CTAB 缓冲液：称取1mol/L Tris-HC₁ 83.5mL,5mo lLNaC1235mL,0.5 mol/LEDTA 33.4 mL, CTAB 固??-20g 定容至1000mL, 混匀。
6.2.20 70%乙醇：量取70mL 无水乙醇，用水定容至100mL。
6.2.21 无菌PCR 反应管。
6.2.22 无菌离心管：1.5 mL、2mL。
6.3 仪器和设备
6.3.1 超净工作台。
6.3.2 电子天平：感量01mg。
6.3.3 离心机：12000r /min。
6.3.4 恒温水浴锅
6.3.5 PCR 扩增仪。
6.3.6 电泳仪。
6.3.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
6.3.8 紫外凝胶成像仪。
6.3.9 灭菌锅。
6.3.10 DNA 测序仪/基团分析仪。
6.3.11 微量移液器：2 μL、10μL、100L、200μL、1000 μL。
6.4 样品制备
将样品混合均匀后称取3g~50 ( 若样品为片状等其他状态则用研钵或粉碎装置粉碎至粉末状), 备用。样品制备应小心操作防止污染和样品组分的改变。
6.5 分析步骤
6.5.1 DNA 模板的提取
称取30 mg～50 mg于6.4.中制备的样品于1.5 mL 离心管中，加入700μuL65℃预热的CTAB 缓冲液， 混匀，置于65℃水浴锅中水浴加热30 min, 期间不时轻轻倒转混匀;待冷却至室温后加入700μL 三氯甲烷：异戊醇(24:1,体积比),轻轻倒转混匀5min～10 min后12000 r/min。 (室温)离心10 min,
小心地转移上清液于洁净离心管中，加入80%体积异丙醇，轻轻混匀，20℃沉??-10 min;12000 r/min。 (室温)离心10 min, 弃上清液;ImL 70%乙醇洗涤2次，晾干;加入适量 TE缓冲液，溶解后-20℃ 保存备用。
注：也可用等效DNA 提取试剂盒提取样品DNA。
6.5.2 DNA 浓度和纯度的测定
取适量DN 溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋日分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和280nm 处的吸光度A260和 A280。DNA的质量浓度按公式(1)计算：
C=A×N×50…………………………(1)
式中：
c——DNA质量农度，单位为微克每毫升(μ g/mL);
A——260nm 处的吸光度;
N——核酸稀释倍数。
当浓度为10 μg/mL～100 uemL,A260/A28o比值在1.7—1.9之间时,适宜角于PCR扩增。
6.5.3 引物
大麦特异性引物序列信息及扩增目的片段长度见表1,各引物终浓度均为10μmol/L。
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表1 特异性引物
6.5.4 PCR 扩增
6.5.4.1 PCR 反应采用25μL 体系：10×DNA buffer 2.5μL,模板DNA 2μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL, 上、下游引物各1μL,Taq DNA聚合酶0.3μL,ddH₂O 补足体积。
6.5.4.2 扩增条件为：95℃ 10 min,95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,72℃ 10min,35个循环。
6.5.4.3 每个 PCR 反应均设置两个平行试验，并设置空白对照、阳性对照和阴性对照，空白对照的 PCR 反应体系中使用无菌双蒸水代替 DNA 模板，阳性对照使用新鲜大麦苗提取的DNA 为模板或已知大麦源性的DNA 为模板，阴性对照采用已知不含大麦序列的DNA 为模板。
6.5.4.4 若样品第一次PCR 扩增结果经电泳检测无条带或条带不清晰，取1μL第一次扩增产物为模板， 在相同反应体系和扩增条件下再次扩增，以第二次PCR 扩增结果进行判断，若第二次PCR 扩增结果经电泳检测仍无条带或条带不清晰则判断该样品中不含有大麦源性成分。
6.5.5 琼脂糖凝胶电泳检测
6.5.5.1 使用1×TAE 缓冲液配制2%琼脂糖凝胶，加热至沸腾溶解后，采取电泳前染色法，当凝胶温度在55℃~60℃时，用微量移液器加入溴化乙锭或其他可替代的染料，使其终浓度达到1 μg/mL, 趁热将琼脂糖溶液均匀倒入制胶器，室温冷却至凝固。
6.5.5.2 在电泳槽中加入1×TAE缓冲液，使溶液没过胶面，移取5μL DNA扩增产物与1 μL6×lo ading buffer(上样液)混合均匀后，点样，同时在点样孔中加入DNA 分子量标记，80V, 恒压，电泳20 min~ 30 min。在紫外凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。
6.5.6 PCR 结果判断
当出现下列情况之一，则PCR结果无效，应重新进行试验：
——两份平行测试样品的结果不一致;
——空白对照或阴性对照出现条带;
——阳性对照未出现目的条带。
6.5.7 确证试验
若PCR扩增结果为阳性，可将所得产物进行测序或利用NruI酶进行酶切反应以确证，酶切反应体系 (30μL):10×buffer 3μL,NruI酶 2 μL,PCR 产物10μL,ddH₂O 16μL; 反应温度为37℃,反应时
间为15min~30 min。酶切产物采用毛细管电泳进行检测。酶切片段及酶切片段信息见表2。
表2 目的片段及酶切片段大小信息
6.6 结果判断
若样品PCR扩增结果出现预期长度的目的片段，且酶切结果符合表2中所对应的酶切片段大小，则判断该样品含有大麦源性成分;或将目的片段测序后，与数据库中已有参考序列比对，相似性≥96%以上，确认样品中含有大麦源性成分。
7 第二法实时荧光PCR法
7.1 原理
以提取的大麦苗粉制品样品中的总DNA为模板，设计大麦源性成分的特异性引物及荧光探针，进行PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定样品中是否含有大麦源性成分。
7.2 试剂和材料
7.2.1 实时荧光PCR 预混液
Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、PC R反应缓冲液、MgCl₂( 3 mmol/L～7mmo/L )、dNTPs ( 含dATP、 dTTP、dCTP、dGTP)、U NG酶等混合配制的溶液或等效的商品化实时荧光PCR反应预混液。
7.2.2 荧光校正试剂
使用时稀释至1×。
7.3 仪器和设备
7.3.1 超净工作台。
7.3.2 电子天平：感量0.1mg。
7.3.3 冷冻离心机：12000r/min。
7.3.4 恒温水浴锅。
7.3.5 实时荧光PCR 仪。
7.3.6 高压灭菌锅。
7.3.7 微量移液器：2 μL、10μL、100μL、200 μL、1000 μL。
7.4 分析步骤
7.4.1 样品制备同6.4。
7.4.2 DNA 模板的提取同6.5.1。
7.4.3 DNA 浓度和纯度的测定同6.5.2。
7.4.4 引物
18S rRNA内参基因以及大麦特异性引物与探针序列见表3,各引物终浓度均为10μmol/L。
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表3 特异性引物及探针序列
7.5 实时荧光PCR 扩增反应
7.5.1 实时荧光PCR 反应体系实时荧光PCR反应体系见表4。
表4 实时荧光PCR反应体系
7.5.2 实时荧光PCR 反应条件
反应条件为：预变性95℃,10s; 变性95℃,5s; 退火延伸60℃,34s, 进行40个循环。不同仪器可根据仪器要求适当调整参数。
7.5.3 实时荧光PCR 结果判断
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
——空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0;
——阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0;
——阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0;
—-18S内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0。
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7.6 结果判断
7.6.1 空白、阳性对照试验和18S 试验结果正常，样品两次平行试验有明显荧光信号检出，且Ct 值均 ≤35.0,则判定被检样品阳性，判断该样品中含有大麦源性成分;样品两次平行试验无荧光信号检出， 且Ct 值均≥40,则判定被检样品阴性，判断该样品中不含有大麦源性成分;
7.6.2 空白、阳性对照试验和18S 试验结果正常，样品两次平行试验有明显荧光信号检出，Ct 值在35～40, 应重新进行实时荧光PCR 反应，再次扩增后Ct 值<40,判断该样品中含有大麦源性成分;否则判断该样品中不含有大麦源性成分。
