中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4933—2025
棉花品种纯度鉴定 SSR分子标记法
Cotton(Gossypium spp L.)varietal purity testing—SSR based methods
2025-12-09 发布
2026-05-01 实施
中华人民共和国农业农村部发布
前言
本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草。
请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。 本文件的发布机构不应承担识别专利的责任。
本文件由农业农村部种业管理司提出。
本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC 37)归口。
本文件起草单位 : 中国农业科学院棉花研究所、全国农业技术推广服务中心、新疆维吾尔自治区种业发展中心、新疆农业科学院、新疆生产建设兵团种子管理总站。
本文件主要起草人 : 匡猛、晋芳、吴玉珍、张胜、彭军、孔杰、金石桥、侯新河、周大云、赖波、黄龙雨、刘丰
泽、黄义文、王延琴、付守阳、栗战帅、帕丽旦 ● 艾海提、高翔、刘金山、张力科、任雪贞、史庆玲、马晓宁、
李曼、廉英杰、王秀芳、吕丽敏、孔德培、刘爱忠、付小琼、李超。
棉花品种纯度鉴定 SSR分子标记法
1 范围
本文件界定了棉花(Gossypium sppL.) 品种纯度 SSR 分子标记方法的术语和定义、缩略语 ,规定了原理、检测方案、试剂和溶液配制、仪器设备、检测程序、结果计算与表示和结果报告。
本文件适用于棉花品种纯度鉴定 ,不适用于转基因品种转化体纯度鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中 ,注日期的引用文件 ,仅
该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 3543 .1 农作物种子检验规程第 1 部分 :总则
GB/T 3543 .2 农作物种子检验规程第 2 部分 :扦样
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3 .1
品种纯度 varietalpurity
品种在特征特性方面典型一致的程度 ,用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。 3 .2
引物 primer
一条互补结合在模板 DNA链上的短单链 ,能提供 3 ,_OH 末端作为 DNA合成的起始点 ,延伸合成模板 DNA 的互补链。
3 .3
组合引物 panel
能够组合在一起电泳、标记不同颜色或相同颜色荧光而扩增片段大小不同的一组引物。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(base pair)
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTPs:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphates)
PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis)
PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
SDS:十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulfate)
SSR:简单序列重复(simple sequence repeat)
Taq酶 :耐热 DNA聚合酶(Taq_DNA polymerase)
5 原理
棉花的不同品种 ,其基因组存在着能够世代稳定遗传的 SSR 的重复次数差异。 这种差异可以通过从抽取有代表性的检测样品中提取 DNA,用 SSR 引物进行扩增和电泳 ,通过检测其扩增产物片段大小而加
以区分。
采用经筛选能准确识别品种异常个体指纹的适宜引物 ,对一定数量送验样品的正常个体数目或百分率进行测算 ,从而对样品整体的典型一致程度作出评价。
6 检测方案
6 .1 总则
样品状况、引物、检测平台不同 ,其检测结果准确度可能有所不同。 应依据 “适于检测目的 ”的原则 ,统
筹考虑检测规模和检测能力 ,选定适宜的样品数量、引物、检测平台 ,制订相应的检测方案。
在严格控制条件下 ,合成选择的引物 ,按照确定的检测平台对检测样品按 DNA 提取、PCR 扩增、电
泳、数据分析的程序进行检测。
按规定要求填报检测结果 ,检验报告应注明影响检测结果的关键信息。
品种纯度鉴定 ,必要时应先对该品种进行真实性鉴定。
6 .2 样品
6 .2 .1 送验样品为种子 ,质量应不低于 500 g。
6 .2 .2 从送验样品中随机分取规定数量的试样 ,试样的分取符合 GB/T 3543 .2 的规定。 试样不少于 100
粒种子 ,检测样品可以是种子、胚芽、幼苗或叶片。
6 .3 引物
6 .3 .1 异常个体的类型不同 ,所选引物和数目也有所不同。
6 .3 .2 常规种纯度检测可采用 10 个 SSR引物同时检测所有个体 ,也可以通过混合样品(70 个个体以上)
试验 ,筛选混合样品中出现杂合的 SSR位点进行检测 ; 杂交种纯度检测需要通过混合样品(70 个个体以
上)试验 ,筛选混合样品中出现杂合的 SSR位点进行检测。 当样品在个别位点存在遗传不稳定状况的 ,可
将该位点剔除 ;检测样品存在严重遗传不稳定状况的 ,可终止纯度检测。
6 .4 检测平台
6 .4 .1 扩增产物可采用变性 PAGE垂直板电泳、毛细管电泳 ,在选择等位基因扩增片段差异较大的引物前提下也可采用非变性 PAGE垂直板电泳。
6 .4 .2 对于检测样品量较大的 ,可将组织研磨仪、DNA 自动提取和移液工作站、高通量 PCR 扩增仪、毛细管电泳仪进行组合 ,提高检测的综合效率。
6 .4 .3 DNA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求 ,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下 ,按照检测平台的要求允许对本文件的规定作适当调整。
6 .5 检测条件
应在有利于检测有效实施的控制条件下进行 ,包括但不限于下列条件 :
a) 种子检验员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能 ;
b) 所有仪器与使用的技术相适应 ,并已经过定期维护、验证和校准 ;
c) 使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材 ;
d) 使用校准影响检测结果评定的适宜参照样品。
7 试剂和溶液配制
7 .1 试剂
7 .1 .1 DNA提取
CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠 (EDTA_Na2 ●2H2 O)、三羟甲基氨基甲烷
(Tris_base)、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、β_巯基乙醇(β_Mercaptoethanol)、乙醇(70%)、SDS、无水乙醇。
7 .1 .2 PCR扩增
引物、DNA、dNTPs、Taq酶、10×缓冲液、ddH2 O 和 Mg2+ 或者 Mix反应混合液。
7 .1 .3 电泳
7 .1 .3 .1 荧光毛细管电泳
DNA分析仪专用的丙烯酰胺胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液。
7 .1 .3 .2 变性 PAGE垂直板电泳
去离子甲酰胺(Formamide)、溴酚蓝(Bromophenol Blue)、二甲苯青 FF、甲叉双丙烯酰胺(Bisacryl_ amide)、丙烯酰胺(Acrylamide)、硼酸(Boric Acid)、尿素、亲和硅烷(Binding Silane)、疏水硅烷(Repel Si_ lane)、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、甲醛、氢氧化钠。
7 .2 溶液配制
DNA提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液参照附录 A 的规定进行配制 ,所用试剂均为分析纯。
试剂配制所用水应符合 GB/T 6682 规定的一级水的要求 ,其中银染溶液的配制可以使用符合三级水的要求。
8 仪器设备
8 .1 DNA提取
高速冷冻离心机、水浴锅或金属浴、紫外分光光度计或核酸浓度测定仪、组织研磨仪。
8 .2 PCR扩增
PCR扩增仪或水浴 PCR扩增装置。
8 .3 电泳
8 .3 .1 毛细管电泳DNA分析仪。
8 .3 .2 变性 PAGE垂直板电泳
高压电泳仪、垂直板电泳槽及制胶附件、水平摇床、胶片观察灯、凝胶成像系统或数码相机。
8 .4 其他器具
微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器、冰箱、染色盒等。
9 检测程序
9 .1 引物的合成和筛选
9 .1 .1 对于棉花常规种纯度检测 ,鉴定异交个体、混杂个体 ,采用本文件推荐的所有引物分析被检个体的基因型 ;对于棉花杂交种纯度检测 ,主要鉴定自交个体、异交个体、混杂个体 ,采用混合 DNA样品(70 个个体以上)筛选 3 对以上杂合位点的 SSR 引物 ,用筛选的 SSR 引物分析被检个体的基因型。 不同类型异常个体的基因型判断可依据以下规则进行确定 :
a) 对于鉴定自交个体 ,识别特征为母本具有该等位基因而父本缺失 ;
b) 对于鉴定异交个体 ,识别特征为母本具有该等位基因而父本错误 ;
c) 对于鉴定混杂个体 ,识别特征为父本具有该等位基因而母本错误或父母本都不具有。
9 .1 .2 本文件推荐了 10 对品种纯度鉴定引物(见表 1) ,特殊情况下可以选取附录 B 表 B.1 的其他引物或其他适宜的引物进行纯度鉴定 ,依据 6 .3 和 9 .1 .1 的要求 ,确定适宜的引物或引物组合。
表 1 品种纯度鉴定推荐引物
表 1 (续)
9 .1 .3 选定引物后在上游或下游引物的 5 ′ 端标记与毛细管电泳仪发射和吸收波长相匹配的荧光染料 ,实现多重电泳 .
9 .2 DNA提取
9 .2 .1 总则
DNA提取方法应保证提取的 DNA数量和质量符合 PCR 扩增的要求 ,DNA 无降解 ,溶液的紫外光吸光度 OD260 与 OD280 的比值宜介于 1 .7 ~ 2 .0 .
DNA提取可选 9 .2 .2 ~ 9 .2 .4 所列的任何一种方法 ,也可选用其他符合 DNA 质量和 PCR 扩增要求的方法 .
9 .2 .2 CTAB法
取试样个体的种子、幼苗或叶片于 2 mL离心管 ,充分研磨 ,每管加入 700 μL 经 65 ℃预热的 CTAB提取液 ,充分混匀 ,65 ℃水浴 30 min. 其间多次轻缓颠倒混匀 . 每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(体积比为 24 ∶ 1)混合液 ,充分混合后静置 10 min,12 000 r/min离心 10 min至分相 . 吸取上清液转移至新的离心管中 ,加入 0 .8 倍体积预冷的异丙醇 ,轻轻颠倒混匀至絮状 DNA 成团析出 . 吸取 DNA,转移至盛有 70%乙醇的离心管中洗涤 1 次 ,无水乙醇再洗涤 1 次 , 自然条件下干燥 ,加入 200 μL超纯水或 TE缓冲液 ,充分溶解后备用 .
9 .2 .3 SDS法
取试样个体的种子、幼苗或叶片于 2 .0 mL离心管 ,充分研磨 ,每管加入 700 μL的 SDS提取液 ,混匀 . 65 ℃水浴 30 min,其间多次轻缓颠倒混匀 . 每管加入等体积的苯酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇(体积比为 25 ∶ 24 ∶ 1)混合液 ,上下颠倒混匀至不分层 ,12 000 r/min离心 10 min. 吸取上清液 ,加入等体积预冷的异丙醇 ,轻轻颠倒混匀至絮状 DNA成团析出 . 吸取 DNA,转移至盛有 70%乙醇的离心管中洗涤 1 次 ,无水乙醇再洗涤 1 次 , 自然条件下干燥 ,加入 200 μL超纯水或 TE缓冲液 ,充分溶解后 4 ℃备用 .
9 .2 .4 试剂盒法
选用适宜 SSR标记法的商业试剂盒 ,并经验证合格后使用 . DNA提取方法 ,按照提供的使用说明进行操作 .
9 .3 PCR扩增
9 .3 .1 总则
对于毛细管电泳检测平台 , 随着毛细管电泳仪使用频次的增加 ,其精确度降低 . 配制反应体系时需要同时设 1 个空白对照、1 个以上参照样品 , 阴性空白对照、参照样品应与检测样品的个体 DNA 同板扩增、同板电泳 ,保证不同上样板和不同批次读取数据的准确性和一致性 . 对于变性 PAGE垂直板电泳 , 当检测个体数不能在同一板完成电泳时 ,不同板之间需要设置试样的 1 个个体或混样作为对照 ,保证不同上样板读取数据的一致性 .
9 .3 .2 反应体系
PCR扩增反应体系的总体积和组分的终浓度参照表 2 进行配置 ,各组分可以依据试验条件不同作相应调整 . 如果表中 10×缓冲液中含有 MgCl2 ,则反应体系中不再加 MgCl2 溶液 ,用等体积的无菌水替代 ;如果使用 2×Taq Mix反应混合液 ,应保证各组分终浓度一致 .
表 2 PCR扩增反应体系
9 .3 .3 反应程序
反应程序中各反应参数可根据 PCR扩增仪型号、Taq酶、引物等不同而作适当的调整 . 通常采用下列反应程序 :
a) 预变性 :94 ℃ 5 min;
b) 扩增 :94 ℃变性 45 s,60 ℃退火 45 s,72 ℃延伸 45 s,共 32 次循环 ;
c) 终延伸 :72 ℃ 10 min.
形成的扩增产物于 4 ℃保存 .
9 .4 扩增产物分离
9 .4 .1 荧光毛细管电泳
9 .4 .1 .1 按照预先确定的组合引物 ,分别取等体积同一组合引物的不同荧光标记的扩增产物 ,充分混匀 .从混合液中吸取 1 μL, 加入 DNA 分析仪专用 96 孔板孔中 . 各孔再分别加入 0 .15 μL分子量内标和8 .85 μL去离子甲酰胺(可根据不同仪器调整用量) ,在 PCR仪上 95 ℃变性 5 min,冷却 10 min以上 ,瞬时离心 10 s后备用 .
9 .4 .1 .2 打开 DNA分析仪 ,检查仪器工作状态和试剂状态 .
9 .4 .1 .3 将装有样品的 96 孔上样板放置于样品架基座上 ,打开数据收集软件 ,按照 DNA分析仪使用手册进行操作 . DNA分析仪将自动运行参数 ,并保存电泳原始数据文件 .
9 .4 .2 变性 PAGE垂直板电泳
9 .4 .2 .1 制胶
沾洗涤灵用清水将玻璃板反复擦洗干净 ,再用去离子水、无水乙醇分别擦洗 2 遍 . 玻璃板干燥后 ,将1 mL亲和硅烷工作液 ,均匀涂在无凹槽的玻璃板上 ;将 1 mL疏水硅烷工作液 ,均匀涂在带凹槽的玻璃板上 . 操作过程中两块玻璃板分别处理 , 防止相互污染 ;玻璃板彻底干燥后 ,将塑料隔条整齐放在无凹槽玻璃板两侧 ,盖上凹槽玻璃板 ,夹子固定后 ,用水平仪检测玻璃胶室是否水平 ;取 60 mL 6% PAGE胶 ,加入100 μL的 TEMED 和 200 μL10% 过硫酸铵(过硫酸铵的用量与温度成反比 ,需根据温度调整用量) ,迅速混匀 ,将胶灌入玻璃胶室 ,灌胶过程应防止气泡的出现 . 待胶室灌满后 ,在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻轻插
入样品梳 ,在室温下聚合 1 h 以上 ,轻轻拔出梳子 ,用清水洗干净备用 .
9 .4 .4 .2 变性
取 20 μL扩增产物 ,加入 5 μL的 6×加样缓冲液 ,混匀 . 95 ℃变性 5 min,4 ℃冷却 10 min后备用 .
9 .4 .4 .3 电泳
9 .4 .4 .3 .1 将清洗后的胶板安装于电泳槽上 , 在电泳正极槽(下槽)与负极槽(上槽)各加入 800 mL 的1×TBE缓冲液 ,拔出样品梳 ,90 W 恒功率预电泳 10 min~ 20 min. 用移液器吹吸加样槽 ,清除气泡与杂质 ,插入样品梳 . 每一个加样孔加入 5 μL变性样品(见 9 .4 .2 .2) ,90 W 恒功率电泳 .
9 .4 .4 .3 .2 电泳的适宜时间参考二甲苯青指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围(见表 B.1)加以确定 . 二甲苯青指示带在 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中移动的位置与 230 bp扩增产物泳动的位置大致相当 . 100 bp~ 200 bp扩增产物的电泳时间约为 35 min;200 bp~ 300 bp扩增产物电泳时间约为40 min,300 bp~450 bp扩增产物电泳时间约为 50 min. 电泳结束后关闭电源 ,取下玻璃板并轻轻撬开 ,凝胶附着在无凹槽的玻璃板上 .
9 .4 .4 .4 染色
将粘有凝胶的无凹槽玻璃板胶面向上浸入 “固定/染色液 ”中 ,轻摇染色槽 ,使 “固定/染色液 ”均匀覆盖胶板 ,染色 5 min~ 10 min. 将胶板移入清水中漂洗 30 s~ 60 s. 再移入显影液中 ,轻摇显影槽 ,使显影液均匀覆盖胶板 ,待带型清晰 ,将胶板移入去离子水中漂洗 5 min, 晾干胶板 ,放在胶片观察灯上观察 ,记录结果 ,用数码相机或凝胶成像系统拍照保存 .
注 : 固定液/染色液、双蒸水和显影液的用量 ,可依据胶板数量和大小调整 , 以没过胶面为准 .
9 .5 数据分析与记录
9 .5 .1 总则
无论是毛细管电泳平台还是变性 PAGE垂直板电泳平台 , 在分析数据时先将遗传不稳定的位点剔除 ,再进行下一步数据分析 .
9 .5 .2 毛细管电泳
当某个体的峰值片段大小在 2 个以上 SSR位点与其他个体存在差异时 ,为异常个体 .
9 .5 .3 垂直板电泳
当某个体的谱带在 2 个以上 SSR位点与其他个体存在差异时 ,为异常个体 .
9 .5 .4 数据记录
将所有个体在被检测位点存在差异或完全相同、数据缺失、无法判定等情形准确记录 .
10 结果计算与表示
检测结果使用正常个体数目(检测试样总数减去异常个体数目)占检测试样总数的百分率表示 .
统计与检测样品正常表现不一致的异常个体数 ,计数个体数目或计算其百分率 ,检测结果的容许差距应符合 GB/T 3543 .1 的要求 .
1 1 结果报告
1 1 .1 按照 GB/T 3543 .1 的检验报告要求 , 以下列方式填报品种纯度的检测结果 :
通过编号为的引物 ,采用方法 , 检测了个个体 , 检测出异常个体个 , 品种纯度为 % .
1 1 .2 属于下列情形之一的 ,应在检验报告中注明 :
a) 送验样品低于 6 .2 .1 规定数量的 ;
b) 检测样品遗传不稳定位点的引物编号清单 ;
c) 检测采用了其他 SSR 引物的名称及序列 .
附录 A
(资料性)
溶液配制
A.1 DNA提取
A.1 .1 0 .5 mol/L EDTA 溶液
称取 186 .1 g Na2 EDTA.2H2 O 溶于 800 mL 水中 , 加固体 NaOH 调 pH 至 8 .0 , 加水定容至1 000 mL,121 ℃ 高压灭菌 20 min。
A.1 .2 1 mol/L TrisG HCl溶液
称取 60 .55 gTris碱溶于适量水中 , 加 HCl调 pH 至 8 .0 , 加水定容至 500 mL, 121 ℃高压灭菌20 min。
A.1 .3 5 mol/L NaCl溶液
称取 146 .1 g 固体 NaCl,加水定容至 500 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
A.1 .4 CTAB提取液
量取 280 mL 的 5 mol/L NaCl、20 mL 的 β_巯基乙醇(C2 H6 OS)、20 g 的 CTAB、100 mL 的 1 mol/L Tris_HCl和 40 mL 的 0 .5 mol/LEDTA,加水定容至 1 000 mL,4 ℃储存。
A.1 .5 SDS提取液
量取 100 mL 的 1 mol/LTris_HCl、25 mL 的 0 .5 mol/LEDTA、25 mL 的 5 mol/L NaCl和 2 .5 g 的SDS混合 ,加水定容至 500 mL。
A.1 .6 5 mol/L KAc
称取 49 .67 g 的 KAc,用水溶解 ,冰乙酸调节 pH 至 5 .2 ,定容至 100 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
A.1 .7 1 × TE 缓冲液
量取 5 mL 的 1 mol/L Tris_HCl和 1 mL 的 0 .5 mol/L EDTA, 加 HCl调 pH 至 8 .0 , 加水定容至500 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
A.2 PCR扩增
A.2 .1 dNTP
用超纯水分别配制 dATP、dGTP、dCTP、dTTP终浓度为 100 mmol/L的储存液 ,分别用 0 .05 mol/L
的 Tris碱调整 pH 至 7 .0。各取 1 .25 mL混合 , 用超纯水 45 mL定容至终浓度 2 .5 mmol/L each 的工
作液。
A.2 .2 SSR 引物
用 1×TE分别配制上游引物、下游引物终浓度均为 100 μmol/L的储存液 ,从 100 μmol/L的储存液中吸取引物 200 μL混合 ,再加入 800 μL的 1×TE混匀成 20 μmol/L的工作液。
A.3 电泳
A.3 .1 6×上样缓冲液
取 98 mL去离子甲酰胺、2 mL 的 0 .5 mol/L EDTA、0 .25 g 的溴酚蓝和 0 .25 g 的二甲苯青混合摇匀 ,4 ℃备用。
A.3 .2 0 .5 mol/L EDTA 溶液
称取 18 .61 g二水合乙二胺四乙酸二钠(EDTA_Na2 ●2H2 O)溶于水中 , 用 NaOH 颗粒将 pH 调至
7
A.3 .3 10 × TBE 缓冲液
称取 108 g 的 Tris碱、55 g 的硼酸和 40 mL 的 0 .5 mol/LEDTA,加水定容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
A.3 .4 6%变性 PAGE胶
称取 420 g 的尿素、50 mL 的 10×TBE缓冲液、57 g 的丙烯酰胺(C3 H5 NO)、3 g 的甲叉双丙烯酰胺[(H2 C=CHCONH) 2 CH2] ,加水定容至 1 000 mL,过滤后备用。
A.3 .5 亲和硅烷工作液
量取 93 mL 的 75% 乙醇、5 mL 的冰醋酸和 2 mL 的亲和硅烷原液 ,混匀。
A.3 .6 疏水硅烷工作液
量取 25 mL 的二甲基二氯硅烷(H2 Cl2 Si)、75 mL 的三氯甲烷(CHCl3)混匀。
A.3 .7 10%过硫酸铵溶液
称取 10 g 的过硫酸铵[(NH4) 2 S2 O8]溶于 100 mL水中。 分装后保存于冰箱冷冻室中备用。
A.1 .8 0 .5 × TBE 工作液
量取 250 mL 的 10×TBE缓冲液 ,加水定容至 5 000 mL。
A.4 银染
A.4 .1 固定液/染色液
称取 2 g 的硝酸银(AgNO3)、133 mL 的 75% 乙醇、6 mL 的 99% 乙酸 ,加水定溶至 1 000 mL。
A.4 .2 NaOH 显影液
称取 20 g 的氢氧化钠(NaOH) ,溶于 1 000 mL 的蒸馏水中。 使用前加入 6 mL 的甲醛(CH2 O)溶液。
附录 B
(资料性)
真实性鉴定引物
表 B.1 列出了 60 对棉花品种真实性鉴定引物的编号、引物名称、染色体位置、引物序列和荧光颜色。
表 B.1 真实性鉴定引物
表 B.1 (续)
表 B.1 (续)
