中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4914—2025
白菜品种及其实质性派生品种鉴定
MNP标记法
Identification of cabbage varieties and their essentially derived varieties—
MNP marker method
2025-12-09 发布
2026-05-01 实施
中华人民共和国农业农村部发布
前言
本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则第 1 部分 :标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .
请注意本文件的某些内容可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .
本文件由农业农村部种业管理司提出 .
本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC 277)归口 .
本文件起草单位 :江汉大学、农业农村部科技发展中心、武汉明了生物科技有限公司、山东省农业科学院作物研究所、武汉市农业科学院、武汉庆发禾盛农业发展有限公司、深圳华大智造科技股份有限公司 .
本文件主要起草人 :周俊飞、张秀杰、陈红、韩瑞玺、李论、彭海、方治伟、李甜甜、郑永胜、高利芬、陈利红、万人静、张静、徐翠容、王鹏、周旭升、李兴需、余进文 .
白菜品种及其实质性派生品种鉴定
MNP标记法
1 范围
本文件规定了利用多核苷酸多态性(Multiple Nucleotide Polymorphism , MNP)标记法进行大白菜[Brassica campestris L. ssp.pekinensis (Lour) Olsson) ] 和不结球白菜 (Brassica campestris ssp. Chinensis)品种及其实质性派生品种鉴定的术语和定义、原理、试剂和材料、仪器设备、操作程序、质量控制、数据分析、结果判定与表述。
本文件适用于大白菜和不结球白菜的品种及其实质性派生品种的鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中 ,注日期的引用文件 ,
仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文
件。
GB/T 3543 .2 农作物种子检测规程第 2 部分 :扦样
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 38551 植物品种鉴定 MNP标记法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3 .1
多核苷酸多态性 multiplenucleotidepolymorphism ,MNP
在一段核苷酸序列中 , 由一个或多个核苷酸变异引起的序列多态性。
[来源 :GB/T 38551 ,3 .1 ,有修改]
3 .2
实质性派生品种 essentiallyderived variety,EDV
由原始品种实质性派生 ,或者由该原始品种的实质性派生品种派生出来的品种 ,与原始品种有明显区别 ,并且除派生引起的性状差异外 ,在表达由原始品种基因型或者基因型组合产生的基本性状方面与原始品种相同。
3 .3
平均覆盖倍数 averagecoverage
在基因组上比对到所有标记位点上的所有测序片段的总数与标记位点总数的比值。
3 .4
检出标记位点 detected markers
至少有一个等位基因型且有 20 条及以上测序片段支持的标记位点。
4 原理
白菜品种的基因组中存在着能够世代稳定遗传的 MNP位点 ,不同白菜品种间同一组 MNP位点的序列上可能存在差异 ,这种差异可通过基于 PCR、二代高通量测序以及生物信息学方法进行检测 ,进而区分不同的品种。
5 试剂和材料
5 .1 多重 PCR扩增与文库构建试剂盒
应匹配 MNP标记和标记检测引物 , 以及高通量测序试剂盒 .
5 .2 高通量测序试剂盒
应匹配高通量测序仪 .
5 .3 MNP标记和标记检测引物
应符合附录 A 的要求 .
6 仪器设备
6 .1 离心机
最大转速度不小于 12 000 r/min.
6 .2 电泳仪
6 .3 PCR扩增仪
6 .4 高通量测序仪
测序读长不低于 300 bp.
6 .5 计算机服务器
7 操作程序
7 .1 样品准备
送检样品为种子、幼苗、叶片等组织或器官 . 试验样品抽取的样本数量宜为 30 个以上 . 样品需要扦样时 ,应符合 GB/T 3543 .2 的规定 . 样品可以混合检测 ,必要时进行个体检测 .
7 .2 DNA提取
7 .2 .1 CTAB法
将混合样品在液氮中研磨至粉末 ,迅速取约 200 mg粉末置于 2 .0 mL离心管中 ;每管加入 600 μL 65 ℃预热的 CTAB提取液 ,充分混合 ,65 ℃水浴 45 min~ 60 min,每间隔 15 min轻缓颠倒混匀 ,水浴后 12 000 r/min离心 10 min. 吸取上清液转移至新的离心管中 , 每管加入与提取液等体积的三氯甲烷和异戊醇 ,轻缓混匀后静置 10 min;12 000 r/min离心 10 min后吸取上清液至新的离心管中 ,加入等体积预冷的
,液,0, i,,iin溶. 上D,
度和1量:以,0推.取 ,其.他 DNA提取方法均适用于本文件 . DNA
溶液的紫外吸光度 OD260 与 OD280 的比值宜介于 1 .7 ~ 2 .0 .
注 2 :三氯甲烷和异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为 24 ∶ 1 .
7 .2 .2 试剂盒提取法(仲裁法)
利用核酸提取试剂盒提取待测样品 DNA. 提取的 DNA 在 260 nm 与 230 nm 处的吸光度值的比值大于 2 .0 ,260 nm 与 280 nm 处的吸光度比值介于 1 . 7 ~ 1 .9 . 方法见附录 C 中的 C.2 .
7 .3 多重 PCR扩增与文库构建
按多重 PCR扩增与文库构建试剂盒的说明书进行 DNA 质控、多重 PCR 扩增、文库构建与纯化 . 其中 ,多重 PCR 的扩增循环数不高于 20 次 . 方法见 C.3 .
7 .4 高通量测序
按高通量测序试剂盒和高通量测序仪的操作说明 ,对 7 .3 中获得的高通量测序文库进行高通量测序 .高通量测序时标记位点的平均覆盖倍数宜设置为 700 倍以上 , 测序片段总读长不小于 300 bp. 方法见C.4 .
8 质量控制
8 .1 环境
样品准备、DNA提取、多重 PCR扩增、文库构建和高通量测序宜在规定的区域或相互隔离的区域按单一方向进行操作 ,不同区域的仪器设备需专用。
8 .2 测序数据
8 .2 .1 高通量测序原始数据质量应满足所采用的高通量测序仪的操作手册中所规定的测序质量要求。
8 .2 .2 将样品的测序数据比对到参考基因组的标记位点上 ,统计第一次检测的标记位点的平均覆盖倍数C1。
8 .2 .3 当 C1 小于 500 时 ,判定样品的测序数据量不足 ,从 7 .4 或之前的步骤开始重新实验至检测标记位点的平均覆盖倍数 C1 大于或等于 500。
8 .2 .4 当 C1 大于或等于 500 时 ,进一步计算检出标记位点的比例 R1。
R1 按公式(1)计算
R1 = × 100…………………………………………… (1)
式中 :
R1 — 样品检出标记位点的比例 ,单位为百分号(%) ;
T1 — 样品检出标记位点的数目 ;
T — 样品检测标记位点的数目。
8 .2 .5 当 R1 大于或等于 95%时 ,判定测序数据合格 ;否则 ,从 7 .2 或之前的步骤重新实验至第二次检出的标记位点的平均覆盖倍数 C2 大于或等于 500。
8 .2 .6 当 C2 大于或等于 500 时 ,进一步计算第一次和第二次共同检出的标记位点的比例 R2。
R2 按公式(2)计算。
R2 = × 100……………………………………… (2)
式中 :
R2 — 第一次和第二次共同检出的标记位点的比例 ,单位为百分号(%) ;
T12 — 第一次和第二次共同检出标记位点的数目 ;
T11 — 第一次检出标记位点的数目 ;
T2 — 第二次检出标记位点的数目。
8 .2 .7 当 R2 大于或等于 95%时 ,判定测序数据合格。
注 : 附录 B提供了一个操作案例 ,其他满足 DNA提取、文库制备和高通量测序的试剂、仪器设备均可。
9 数据分析
9 .1 测序数据比对与记录
9 .1 .1 将测序数据比对到参考基因组上的每个 MNP标记位点上。
9 .1 .2 位点的基因型指该位点的所有检出等位基因型 ,其中 ,检出等位基因型指从该标记第一个到最后一个碱基构成的检出 DNA 片段 ,不同检出等位基因型用 “/”隔开。 位点的基因型记录实例见 C.8。
9 .2 遗传相似度计算
遗传相似度按公式(3)计算。
GS= × 100………………………………………… (3)
式中 :
GS — 待测品种与对照品种的遗传相似度 ,单位为百分号(%) ;
nij — 待测品种与对照品种中均检出的但基因型无任何差异的标记位点的数目 ; Nij — 待测品种与对照品种中均检出标记位点的数目。
10 结果判定与表述
10 .1 品种鉴定
10 .1 .1 当待测品种与对照品种的 GS小于 96 .00%时 ,判定为“不同品种 ”.
10 .1 .2 当待测品种与对照品种的 GS大于或等于 96 .00%时 ,判定为“疑同品种 ”.
10 .2 实质性派生品种判定
10 .2 .1 当待测品种与对照品种的 GS小于 90 .00%时 ,判定为“非实质性派生品种 ”.
10 .2 .2 当待测品种与对照品种的 GS大于或等于 90 .00%时 ,判定为“疑似实质性派生品种 ”.
10 .3 结果表述
待测品种与对照品种 · 比较位点数为 ,差异位点数为 ,遗传相似度为 ,判定为 .
示例 1 :待测品种 A与对照品种 B 比较位点数为 510 ,差异位点数为 2 ,遗传相似度为 99 .61% ,判定为疑同品种 .
示例 2 :待测品种 A与对照品种 B 比较位点数为 512 ,差异位点数为 60 ,遗传相似度为 88 .28% ,判定为非实质性派生品种 .
注 :结果表述也可采用表格形式 ,但需完整包含上述内容 .
附录 A
(规范性)
MNP标记和标记检测引物
MNP标记编号、染色体位置、引物序列、变异类型、参照品种等信息见表 A.1。
表 A.1 MNP标记和标记检测引物
表 A.1 (续)
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附录 B (资料性)
DNA提取溶液配制
B.1 0.5 mol/L EDTA 溶液
称取 186 .1 g Na2 EDTA . 2H2 O 溶于 800 mL水中 ,充分搅拌溶解 ,加 NaOH 调 pH 至 8 .0 ,加水定容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
B.2 0.5 mol/L HCl溶液
量取 25 mL浓盐酸(质量分数为 36% ~ 38%) ,加水定容至 500 mL。
B.3 1 mol/L NaOH 溶液
称取 40 .0 g NaOH 溶于 800 mL水中 ,充分搅拌溶解 ,加水定容至 1 000 mL。
B.4 1 mol/L TrisG HCl溶液
称取 60 .55 g三羟甲基氨基甲烷溶于 400 mL水中 ,加 HCl调 pH 至 8 .0 ,加水定容至 500 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
B.5 CTAB提取液
称取 20 .0 g CTAB、81 .7 g NaCl置于 1 000 mL 烧杯中 , 量取 100 mL 1 mol/L Tris_HCl溶液和40 mL 0 .5 mol/LEDTA溶液倒入烧杯中 ,加 700 mL水 ,充分搅拌溶解 ,加水定容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
B.6 TE 缓冲液
量取 5 mL 1 mol/LTris_HCl溶液和 1 mL0 .5 mol/LEDTA溶液 ,加水定容至 500 mL,121 ℃高压灭菌 20 min,4 ℃保存。
附录 C
(资料性)
品种鉴定流程示例
C.1 样品准备
白菜样品来源于农业农村部科技发展中心 . 待测样品名称‘速绿 117 ’,实验编号 BC240407002;对照样品名称‘黑将军 ’,实验编号 BC240407001 .
从待测样品与对照样品中分别抽取 30 粒以上的种子 ,发芽至幼苗长度为 5 cm~ 10 cm. 每棵幼苗的叶片取约 10 mm 圆片 ,装入离心管中 .
C.2 DNA提取
采用某公司生产的新型植物基因组 DNA提取试剂盒提取白菜叶片 DNA,具体步骤如下 :
a) 向装有叶片的离心管中加入液氮充分碾磨后 , 加入 400 μL缓冲液 LP1 和 6 μL RNase A (10 mg/mL) ,涡旋振荡 1 min,室温放置 10 min.
b) 加入 130 μL缓冲液 LP2 ,充分混匀 ,涡旋振荡 1 min.
c) 12 000 r/min离心 5 min,将上清液移至新的离心管中 .
d) 加入 1 .5 倍体积的缓冲液 LP3 (使用前请先检查是否已加入无水乙醇) ,立即充分振荡混匀 15 s,此时可能会出现絮状沉淀 .
e) 将上一步所得溶液和絮状沉淀加入一个吸附柱 CB3 中 (吸附柱放入收集管中) , 12 000 r/min离心 30 s,倒掉废液 , 吸附柱 CB3 放入收集管中 .
f) 向吸附柱 CB3 中加入 600 μL漂洗液 PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇) , 12 000 r/min离心 30 s,倒掉废液 ,将吸附柱 CB3 放入收集管中 .
g) 重复操作步骤 f) .
h) 将吸附柱 CB3 放回收集管中 ,12 000 r/min离心 2 min,倒掉废液 . 将吸附柱 CB3 室温放置数分钟 ,彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液 .
i) 将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管中 , 向吸附膜的中间部分悬空滴加 50 μL洗脱缓冲液 TE,
温,Ni min,12 000 r/min离心 2 min,将溶液收集到离心管中 . 产物放于- 20 ℃冰
j) DNA质检 . 用分光光度计测定并计算 BC240407002 和 BC240407001 的 DNA 溶液在 260 nm与 280 nm 处的吸光度比值 ,分别为 1 .86 和 1 .89 . 在 260 nm 与 230 nm 处的吸光度比值分别为
2 .02 和 2 .04;取 4 μL DNA 在 1%的琼脂糖凝胶上电泳 , 检测 DNA 条带是否完整 , 结果如图C.1 所示 ;取 1 μL DNA用 Qubit荧光定量仪测定 BC240407002 和 BC240407001 的 DNA浓度 ,分别为 29 .4 ng/μL和 35 .2 ng/μL.
C.3 多重 PCR扩增与文库构建
C.3 .1 多重 PCR扩增
采用某公司生产的多重扩增试剂盒进行多重 PCR扩增与文库构建 ,该试剂盒匹配后续步骤中某公司的测序平台 ,需自备 80%乙醇 ,其余试剂均为试剂盒提供 .
由于 BC240407002 与 BC240407001 的多重 PCR扩增与文库构建实验流程完全一样 , 因此 ,除特别说明 ,下面仅就 BC240407002 的实验流程进行说明 .
a) 配制多重 PCR扩增体系 . 在 PCR 管中加入 4 μL表 A.1 中的多重 PCR 引物混合物(每条引物
图 C.1 BC240407002 和 BC240407001 的 DNA 电泳图
