中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4829—2025
蜂王浆及其冻干粉中蜂王浆主蛋白4的测定酶联免疫吸附法
Determination of major royal jelly protein 4 in royal jelly and lyophilized
royal jelly powder—Enzymelinked immunosorbent assay
2025-12-09 发布
2026-05-01 实施
中华人民共和国农业农村部发布
前言
本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .
请注意本文件的某些内容可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出 .
本文件由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC 274)归口 .
本文件起草单位 : 中国农业科学院蜜蜂研究所、辽宁省农业发展服务中心、武汉市葆春蜂王浆有限责任公司、浙江花谷源蜂业有限公司 .
本文件主要起草人 :胡菡、吕国达、赵文、王鹏、孟丽峰、冯毛、魏俏红、李建科、徐士磊、朱黎、刘春福、刘西子 .
蜂王浆及其冻干粉中蜂王浆主蛋白 4 的测定酶联免疫吸附法
1 范围
本文件描述了蜂王浆及其冻干粉中蜂王浆主蛋白 4 的酶联免疫吸附测定方法 .
本文件适用于蜂王浆及其冻干粉中蜂王浆主蛋白 4 含量的测定 .
本文件方法中蜂王浆主蛋白 4 在蜂王浆中的检出限为 7 mg/kg,定量限为 65 mg/kg;在蜂王浆冻干粉中的检出限为 14 mg/kg,定量限为 130 mg/kg.
注 :蜂王浆主蛋白 4 是蜂王浆主蛋白之一 ,其含量能够反映蜂王浆的新鲜度 .
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 . 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ; 不注日期的引用文件 , 其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 .
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义 .
4 原理
采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定蜂王浆主蛋白 4 的含量 . 样品中的蜂王浆主蛋白 4 与酶标板上包被的特异性抗体结合 ,形成抗体抗原复合物 ; 加入酶标抗体后形成抗体抗原抗体复合物 ; 加底物显色 ,酶标仪测定 450 nm 处的吸光度值 ,根据吸光度值计算蜂王浆主蛋白 4 浓度 ,外标法定量 . 吸光度值与样品中的蜂王浆主蛋白 4 含量成正比 .
5 试剂或材料
除非另有说明 ,仅使用分析纯试剂 .
5 .1 水 :GB/T 6682 ,三级 .
5 .2 测定试剂盒中包含的试剂见附录 A.
5 .3 蜂王浆主蛋白 4 对照品系列溶液配置 :取 1 支蜂王浆主蛋白 4 对照品 100 ng(A.2) ,准确加入 1 mL水充分溶解 ,得到 100 ng/mL对照品溶液 ,然后依次用水倍比稀释成 50 ng/mL、25 ng/mL、12 .5 ng/mL、 6 .125 ng/mL、0 ng/mL 的对照品系列溶液 , 临用现配 .
5 .4 生物素标记抗体工作液 : 生物素标记抗体 (A.3) + 生物素标记抗体稀释液 (A.4) = 1 + 99 , 临用
5 .5 辣根过氧化物酶标记亲和素工作液 :辣根过氧化物酶标记亲和素(A.5) + 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液(A.6)= 1+99 , 临用现配 .
5 .6 洗涤溶液 :浓洗涤液(A.7)+水= 1+24 , 临用现配 .
5 .7 空白试样溶液 :空白试样采用水替代试样 ,并与试样同步进行试验 .
5 .8 阳性质控溶液 :取任一试样 ,根据其蜂王浆主蛋白 4 的含量选择一个合适的浓度进行添加 ,与试样同步进行试验 , 以确定试验过程的操作准确性 .
6 仪器设备
6 .1 酶标仪 :检测波长精度 ±2 nm.
6 .2 分析天平 :精度为 0 .001 g.
6 .3 冷冻离心机 :转速不低于 1 2000 r/min.
6 .4 涡旋振荡器 .
6 .5 单道和多道加样器 .
6 .6 恒温培养箱 :控温精度 ±1 ℃ .
6 .7 超声波清洗仪 .
7 样品
取蜂王浆 200 g 于密闭容器中 , - 18 ℃储存不超过 2 个月 ;蜂王浆冻干粉 200 g 于密闭容器中 ,4 ℃以
8 试验步骤
8 .1 提取
平行做两份试验 . 称取约 1 g蜂王浆或蜂王浆冻干粉试样(精确至 0 .001 g)于 50 mL离心管中 ,加水40 mL,室温下充分振荡 20 min,或 20 ℃以下超声 10 min,转移至 100 mL容量瓶中 . 离心管用少量水洗涤 3 次 ,洗液并入容量瓶中 ,并定容至 100 mL(V) ,混匀 . 取适量溶液于 4 ℃、12 000 r/min离心 15 min,上清液备用 .
8 .2 稀释
8 .2 .1 蜂王浆
准确移取 1 mL上清液(8 .1)于 100 mL容量瓶中 ,用水稀释定容至 100 mL(n,稀释 100 倍) ,混匀 ,为待测试样溶液 .
8 .2 .2 蜂王浆冻干粉
准确移取 1 mL上清液(8 .1)于 200 mL容量瓶中 ,用水稀释定容至 200 mL(n,稀释 200 倍) ,混匀 ,为待测试样溶液 .
8 .3 测定
注意 :测定前包被好蜂王浆主蛋白 4 抗体的酶标板以及所有试剂和溶液均应回温至室温(20 ℃ ±5 ℃) .
8 .3 .1 在包被好蜂王浆主蛋白 4 抗体的微孔板中 ,依次加入 100 μL蜂王浆主蛋白 4 对照品系列溶液(5 .3)、空白试样溶液(5 .7)、阳性质控试样溶液(5 .8)和待测样品溶液(8 .2) ,覆上板贴 , 36 ℃温育 2 h.
8 .3 .2 弃去孔内液体 ,在吸水纸上用力磕掉残留液体 ,不用洗涤 .
8 .3 .3 每孔加入生物素标记抗体工作溶液(5 .4)100 μL,覆盖板贴 ,36 ℃温育 1 h.
8 .3 .4 弃去孔内液体 ,每孔加入 200 μL洗涤溶液(5 .6) ,浸泡 2 min,轻轻晃动后弃去溶液 ,在吸水纸上用力磕掉残留液体 ,重复洗涤 3 次 .
8 .3 .5 每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(5 .5)100 μL,覆上板贴 ,36 ℃温育 1 h.
8 .3 .6 重复步骤 8 .3 .4 操作 ,重复洗涤 5 次 .
8 .3 .7 依序向每孔加底物溶液(A.8)90 μL,覆上板贴 ,36 ℃避光显色 15 min~ 20 min.
8 .3 .8 依序向每孔加入终止溶液(A.9)50 μL终止反应 ,在 5 min 内置酶标仪上 ,450 nm 波长读取各孔溶液的吸光度值 .
注 :如上测定也可按照检测试剂盒说明书的操作步骤进行 .
8 .4 标准曲线绘制
以蜂王浆主蛋白 4对照品系列溶液质量浓度的对数(lg)为横坐标 , 以平均吸光度值为纵坐标绘制标准曲线 ,相关系数不低于 0 .99 . 试样溶液中蜂王浆主蛋白 4 的浓度应在标准曲线的线性范围内 . 如果试样中蜂王浆主蛋白 4 含量超出线性范围 ,则用水稀释(n倍) ,重新测定 .
9 试验数据处理
蜂王浆及其冻干粉中蜂王浆主蛋白 4 的含量以质量分数 w 计 ,数值以毫克每千克(mg/kg)表示。 从
标准曲线上得到蜂王浆主蛋白 4 浓度(C)后 ,按公式(1)计算。
W…………………………………………… (1)
式中 :
C — 从标准工作曲线上得到的试样溶液中蜂王浆主蛋白 4浓度 ,单位为纳克每毫升(ng/mL) ; V — 待测试样溶液体积 ,单位为毫升(mL) ;
n — 试样稀释倍数 ;
m — 试样质量 ,单位为克(g) ; 1000 — 换算系数。
测定结果以平行测定的算术平均值表示 ,计算结果保留到小数点后两位。
10 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过该算术平均值的 20%。
附录 A
(资料性)
蜂王浆主蛋白 4 测定试剂盒
A.1 包被好蜂王浆主蛋白 4 抗体的 96 孔酶标板 .
A.2 蜂王浆主蛋白 4 对照品(纯度 > 80%) :100 ng/支 ,冷冻保存 .
A.3 生物素标记抗体 .
A.4 生物素标记抗体稀释液 .
A.5 辣根过氧化物酶标记亲和素 .
A.6 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 .
A.7 浓洗涤液 .
A.8 底物溶液 :注意避光保存 .
A.9 终止液 .
A.10 板贴 .
