中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2466—2025代替 NY/T 2466—2013
大麦品种鉴定 SSR分子标记法
Identification of barley varieties—SSR marker method
2025-12-09 发布
2026-05-01 实施
中华人民共和国农业农村部发布
前言
本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则第 1 部分 :标准化文件的结构和起草规则»的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件代替 NY/T 2466—2013« 大麦品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法» , 与 NY/T 2466—2013相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :
a) 推荐引物增加到 35 对 ,保留了原来 26 对引物 ,删除了原来 2 对引物 ,新增了 9 对引物 ;
b) 增加了结果表述条目 ;
c) 调整了 15 对引物的等位变异 ;
d) 调整了 15 对引物的参照品种。
本文件由农业农村部种业管理司提出。
本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC 277)归口。
本文件起草单位 :江苏省农业科学院、农业农村部科技发展中心。
本文件主要起草人 :王艳平、马莹雪、于堃、沈奇、张凯淅、刘晓宏、潘红、王显生、李华勇、汪鸿星。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :
— 2013 年首次发布为 NY/T 2466—2013 ;
— 本次为第一次修订。
大麦品种鉴定 SSR 分子标记法
1 范围
本文件规定了利用简单重复序列 (SSR)分子标记进行大麦原变种 (Hordeum vulgare var.vulgare L.) 和青稞变种(Hordeum vulgare var.nudum L.) 品种鉴定的原理、主要仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息及使用、参照品种及使用、操作程序、结果判定与表述。
本文件适用于大麦原变种和青稞变种的 DNA分子数据采集和品种鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ; 不注日期的引用文件 , 其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 3543 .2 农作物种子检验规程第 2 部分 :扦样
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 2594 植物品种鉴定 DNA分子标记法总则
3 术语和定义
NY/T 2594 界定的术语和定义适用于本文件。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(base pair)。
SDS:十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)。
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)。
PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)。
SSR:简单重复序列(simple sequence repeat)。
Taq酶 :耐热 DNA聚合酶(Taq_DNA polymerase)。
5 原理
大麦品种基因组存在着大量能够稳定遗传的 SSR 标记 , 不同大麦品种在同一 SSR 的重复次数存在差异 ,这种差异可通过 PCR扩增及电泳方法进行检测 ,进而区分不同的大麦品种。
6 主要仪器设备及试剂
主要仪器设备及试剂见附录 A。
7 溶液配制
溶液配制方法见附录 B。
8 引物信息及使用
利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物 ,荧光标记位于正向引物 5 ′端 ,推荐的荧光标记见附录 D.可利用附录 C 中的引物序贯检测 , 当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品不同时 ,停止检测 .
9 参照品种及使用
参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异 ,宜与送检样品同时检测 ,参照品种相关信息见附录 E.
10 操作程序
10 .1 样品准备
送验样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官 . 种子样品需扦样时 ,应符合 GB/T 3543 .2 的要求 . 每份样品不少于 10 个个体 ,等量混合分析 ,必要时进行个体检测 .
10 .2 DNA 提取
取大麦的幼苗或叶片 0 .5 g,剪碎 ,放入 2 mL离心管中 ,往离心管中加入液氮 ,放入研磨仪 ,磨成粉状后立即加入 800 μL预热的 SDS提取液 ,剧烈摇动混匀 ,并在 65 ℃水浴中保温 30 min~ 50 min,其间可摇动几次 . 冷却至室温加入等体积三氯甲烷异戊醇 (24 ∶ 1 ,V ∶V) , 轻缓颠倒混匀 , 室温下静置 5 min~ 10 min,使水相和有机相分层 . 12 000 r/min离心 10 min. 移取上清液至另一 2 mL 离心管中 , 加入约1 .5 倍体积的预冷乙醇 ,轻缓颠倒混匀 ,经 12 000 r/min离心 3 min至分相 ,弃上清液 . 用 70% 乙醇溶液洗涤 2 遍 , 自然条件下干燥后 ,加入 50 μL 1 ×TE 缓冲液溶解沉淀 . 用紫外分光光度计检测 DNA浓度与
纯度注,将:以N .,D满.增要求的其他 DNA 提取方法都适用于本文件 . DNA
溶液的紫外吸光度 OD260 与 OD280 的比值宜介于 1 .7 ~ 2 .0 .
10 .3 PCR 扩增
10 .3 .1 反应体系
PCR扩增反应体系的总体积和各组分的浓度参照表 1 配制 ,可以依据试验条件调整 .
表 1 PCR扩增反应体系
10 .3 .2 反应程序
推荐反应程序为 :94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s,47 ℃ ~ 62 ℃ (可根据附表 D推荐的引物设定退火温度)退火 30 s,72 ℃延伸 1 min,共 35 个循环;72 ℃延伸 5 min,4 ℃保存 .
反应参数可根据 PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而作适当的调整 .
10 .4 PCR 产物电泳
10 .4 .1 垂直板变性 PAGE
10 .4 .1 .1 制胶
将玻璃板清洗干净 ,再用双蒸水、无水乙醇分别擦洗 2 遍 . 玻璃板干燥后 ,将 0 .5 mL亲和硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上 ,将 0 .5 mL剥离硅烷工作液均匀涂在带凹槽的短玻璃板上 . 操作过程中应防止两块玻璃板互相污染 . 玻璃板彻底干燥后 ,将 0 .4 mm 厚的塑料隔条整齐放在长玻璃板两侧 ,盖上凹槽短
玻璃板 ,用夹子固定 ,用水平仪调平。 取 100 mL质量分数为 6%的变性 PAGE胶溶液 ,加入 50 μL 四甲
基乙二胺(TEMED)和 500 μL质量分数为 10%的过硫酸铵(APS) ,迅速混匀 ,将胶灌入玻璃胶室 ,灌胶过
程中应防止出现气泡。 待胶液充满玻璃板夹层 , 将 0 .4 mm 厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻插入胶液约
4 mm ,室温聚合 1 h 以上 ,胶聚合后 ,清理胶板表面溢出的胶液 ,轻轻拔出梳子 ,用水清洗干净备用。
10 .4 .1 .2 变性
在 20 μLPCR产物中加入 5 μL6×加样缓冲液 ,混匀。 在 PCR扩增仪上运行 95 ℃变性 5 min,4 ℃
冷却 10 min以上备用。
10 .4 .1 .3 电泳
将胶板安装于电泳槽上 ,在电泳正极槽和负极槽各加入 600 mL 的 1 × TBE 缓冲液 , 使其没过电极
线。1 800 V恒压预电泳 10 min~ 20 min,断开电源。 用移液器吸取加样槽 ,清除气泡和杂质。 将样品梳
± 30)bp范围的 , 电泳参考时间分别为 1 .5 h、2 .0 h、2 .5 h、3 .5 h, 当等位变异碱基对数差异较小时 ,可适
当延长电泳时间。 电泳结束后关闭电源 ,取下玻璃板并轻轻撬开 ,凝胶附着在长玻璃板上。
10 .4 .1 .4 染色
将附着凝胶的长玻璃板胶面向上浸入固定液中轻轻晃动 3 min后取出 ,在双蒸水中快速漂洗 , 时间不超过 10 s;将胶板放入染色液中 ,轻轻晃动 5 min~ 10 min后取出 ,在双蒸水中快速漂洗 ,时间不超过 10 s;将胶板放入显影液中 ,轻摇晃动待条带清晰后取出 ,再迅速放入固定液中定影 5 min取出 ,在双蒸水中漂洗 1 min;取出胶板 , 晾干 ,放在胶片观察灯上观察 ,记录结果 ,拍照保存。
注 : 固定液、染色液、双蒸水和显影液的用量 , 以淹没胶面为准。
10 .4 .2 荧光毛细管电泳
10 .4 .2 .1 PCR产物样品准备
根据预先确定的引物分组(见附录 F) ,依据预实验结果按照扩增效率分别取合适体积的荧光标记的扩增产物 ,混匀稀释。 吸取 1 μL混合液加入 DNA分析仪配套上样板中。
注 :稀释倍数通过荧光毛细管电泳预实验确定。
10 .4 .2 .2 变性
上样板中各孔分别加入 0 .1 μL分子量内标和 8 .9 μL去离子甲酰胺。 在 PCR 扩增仪上 95 ℃变性
5 min,取出后立即置于碎冰上 ,冷却 10 min 以上 ,瞬时离心 10 s 后备用。
10 .4 .2 .3 电泳
按照 DNA分析仪使用手册进行操作 ,并保存电泳原始数据文件。
10 .5 数据分析
10 .5 .1 等位变异确定与记录
在某一位点扩增片段的迁移位置与对应的参照品种进行比较 ,确定送检样品在该位点的等位变异。 对于
荧光毛细管电泳 ,通过参照品种消除不同批次或者不同型号 DNA分析仪可能存在的系统误差 ,使用片段
分析软件读取送检样品在该位点的等位变异。
纯合位点的等位变异数据记录为 X/X ,杂合位点的等位变异数据记录为 X/Y,其中 X、Y 分别为该位点上的 2 个等位变异 ,小片段数据在前 ,大片段数据在后。 缺失位点的等位变异数据记录为 0/0。
示例 1 :样品在某个位点上仅出现 1 个等位变异 ,为 100 bp,则该位点的等位变异数据记录为 100/100。
示例 2 :样品在某个位点上有 2 个等位变异 ,分别为 100 bp、105 bp,则该位点的等位变异数据记录为 100/105。
10 .5 .2 数据比对与差异位点统计
逐一比对送检样品与对照样品每个位点的等位变异数据 ,按照位点相同、位点差异、数据缺失、无法判
定情形 ,记录每个位点的比对结果 ,统计检测位点数和差异位点数 .
1 1 结果判定与表述
1 1 .1 判定规则
当差异位点数大于 2 ,判定为 “不同 ”; 当差异位点数小于等于 2 ,判定为 “疑同 ”.
1 1 .2 结果表述
送检样品与对照样品 (或对照样品品种指纹)采用电泳检测 ,检测位点数为 ,差异位点数为 ,判定为 .
附录 A
(规范性)
主要仪器设备及试剂
A.1 主要仪器设备
A.1 .1 PCR扩增仪。
A.1 .2 高压电泳仪 :最高电压不低于 2 000 V,具有恒电压、恒电流和恒功率功能。
A.1 .3 垂直电泳槽及配套的制胶附件。
A.1 .4 离心机。
A.1 .5 水平摇床。
A.1 .6 胶片观察灯。
A.1 .7 电子天平 :感量为 0 .1 g 和 0 .01 g。
A.1 .8 微量移液器 :规格分别为 10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL,连续可调。
A.1 .9 磁力搅拌器。
A.1 .10 核酸浓度测定仪或超微量紫外分光光度计。
A.1 .1 1 植物组织研磨仪。
A.1 .12 高压灭菌锅。
A.1 .13 酸度计。
A.1 .14 水浴锅或金属浴。
A.1 .15 低温冰箱。
A.1 .16 制冰机。
A.1 .17 凝胶成像系统或紫外透射仪。
A.1 .18 DNA分析仪 :基于毛细管电泳 ,有片段分析功能和数据分析软件 ,最低分辨率 1 bp。
A.1 .19 其他相关仪器和设备。
A.2 主要试剂
除非另有说明 ,均使用分析纯试剂。
A.2 .1 十二烷基硫酸钠(SDS,C12 H25 SO4 Na,CAS号 :151__21__3)。
A.2 .2 三氯甲烷(CHCl3 ,CAS号 :67__66__3)。
A.2 .3 异戊醇(C5 H1 2 O,CAS号 :123__51__3)。
A.2 .4 乙二胺四乙酸二钠二水合物(Na2 EDTA . 2H2 O,C10 H18 N2 Na2 O10 ,CAS号 :6381__92__6)。
A.2 .5 三羟甲基氨基甲烷(Tris,C4 H11 NO3 ,CAS号 :77__86__1)。
A.2 .6 浓盐酸(HCl,CAS号 :7647__01__0)。
A.2 .7 氢氧化钠(NaOH ,CAS号 :1310__73__2)。
A.2 .8 氯化钠(NaCl,CAS号 :7647__14__5)。
A.2 .9 10×PCR缓冲液 :含 Mg2 + 25 mmol/L。
A.2 .10 4 种脱氧核糖核苷酸 :dATP、dTTP、dGTP、dCTP。
A.2 .1 1 SSR 引物。
A.2 .12 Taq DNA聚合酶(Taq酶 ,CAS号 :9012G 90G2) .
A.2 .13 DNA Marker:DNA 片段分布范围在 50 bp~ 500 bp.
A.2 .14 甲酰胺(CH3 NO,CAS号 :75G 12G 7) .
A.2 .15 溴酚蓝(C19 H10 Br4 O5 S,CAS号 :115G39G 9) .
A.2 .16 二甲苯青(C25 H27 N2 NaO6 S2 ,CAS号 :2650G 17G 1) .
A.2 .17 甲叉双丙烯酰胺[(H2 C=CHCONH) 2 CH2 ,CAS号 :110G26G 9] . A.2 .18 丙烯酰胺(C3 H5 NO,CAS号 :79G06G 1) .
A.2 .19 硼酸(H3 BO3 ,CAS号 :10043G35G3) .
A.2 .20 尿素(CH4 N2 O,CAS号 :57G 13G 6) .
A.2 .21 亲和硅烷 .
A.2 .22 二甲基二氯硅烷(C2 H6 Cl2 Si,CAS号 :75G 78G 5) .
A.2 .23 无水乙醇(C2 H6 O,CAS号 :64G 17G 5) .
A.2 .24 四甲基乙二胺(TEMED,C6 H16 N2 ,CAS号 :110G 18G 9) .
A.2 .25 过硫酸铵[APS, (NH4) 2 S2 O8 ,CAS号 :7727G 54G0] .
A.2 .26 冰醋酸(CH3 COOH ,CAS号 :64G 19G 7) .
A.2 .27 硝酸银(AgNO3 ,CAS号 :7761G88G8) .
A.2 .28 甲醛(HCHO,CAS号 :50G00G0) .
A.2 .29 DNA分析仪用丙烯酰胺胶液 .
A.2 .30 DNA分析仪用分子量内标 .
A.2 .31 DNA分析仪用电泳缓冲液 .
A.2 .32 DNA分析仪用光谱校准基质 .
附录 B (规范性)溶液配制
试剂配制用水应符合 GB/T 6682 的要求。
B.1 DNA 提取溶液的配制
B.1 .1 1 mol/L氢氧化钠溶液
称取 40 .0 g 氢氧化钠 ,溶于 800 mL去离子水中 ,冷却至室温 ,定容至 1 000 mL。
B.1 .2 0.5 mol/L盐酸溶液
量取 25 mL浓盐酸(36% ~ 38%) ,加去离子水定容至 500 mL。 B.1 .3 0.5 mol/L EDTA(pH8 .0)溶液
后 ,冷却至室温。 再用氢氧化钠溶液 (B.1 .1) 准确调 pH 至 8 .0 , 定容至 1 000 mL。 在 103 .4 kPa
(121 ℃)条件下灭菌 20 min。
B.1 .4 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(pH 8.0)溶液
称取 60 .55 g三羟甲基氨基甲烷 ,溶于 400 mL去离子水中 ,用盐酸溶液(B.1 .2)调 pH 至 8 .0 ,定容至 500 mL,在 103 .4 kPa(121 ℃)条件下灭菌 20 min。
B.1 .5 5 mol/L氯化钠溶液
称取 292 .2 g 氯化钠 , 溶于 750 mL 去离子水中 , 定容至 1 000 mL, 在 103 .4 kPa(121 ℃) 灭菌20 min。
B.1 .6 SDS提取液
称取 15 .0 g 十二烷基硫酸钠 ,分别加入 40 mLEDTA溶液(pH8 .0)(B.1 .3)、100 mL 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(pH 8 .0)(B.1 .4)和 100 mL 5 mol/L氯化钠溶液(B.1 .5) ,搅拌 ,待溶解后定容至 1 000 mL。在 103 .4 kPa(121 ℃)条件下灭菌 20 min。 于 4 ℃保存。
B.1 .7 三氯甲烷异戊醇(24 ∶ 1)
按 24 ∶ 1 的比例(V ∶ V)配制混合液。
B.1 .8 TE 缓冲液
分别量取 5 mL 三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液 (pH 8 .0) (B.1 .4) 和 1 mL EDTA 溶液 (pH 8 .0) (B.1 .3) ,定容至 500 mL,在 103 .4 kPa(121 ℃)条件下灭菌 20 min。 于 4 ℃下保存。
B.2 PCR 扩增溶液的配制
B.2 .1 dNTP溶液
用超纯水分别配制 dATP、dTTP、dGTP、dCTP4 种脱氧核糖核苷酸终浓度为 100 mmol/L 的储存
液。分别量取 4 种储存液 20 μL混合 ,用 120 μL超纯水定容 ,配制成每种核苷酸终浓度为 10 mmol/L的
用 TE 缓冲液或超纯水分别配制正向引物和反向引物浓度为 10 μmol/L的工作液。
B.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制
B.3 .1 10×TBE缓冲液
分别称取 108 .0 g三羟甲基氨基甲烷和 55 .0 g 硼酸 ,溶于 800 mL去离子水中 ,加入 37 mL EDTA溶液(pH8 .0)(B.1 .3) ,定容至 1 000 mL。
B.3 .2 40%丙烯酰胺溶液
分别称取 190 .0 g丙烯酰胺和 10 .0 g 甲叉双丙烯酰胺 ,溶于 400 mL去离子水中 ,定容至 500 mL。
B.3 .3 6% 变性聚丙烯酰胺溶液
称取 420 g尿素 ,用去离子水溶解 ,分别加入 100 mL 10×TBE缓冲液(B.3 .1)和 150 mL 40%丙烯酰胺溶液(B.3 .2) ,定容至 1 000 mL。
B.3 .4 亲和硅烷缓冲液
分别量取 49 .75 mL无水乙醇和 250 μL冰醋酸 ,用去离子水定容至 50 mL。
B.3 .5 亲和硅烷工作液
分别量取 5 μL亲和硅烷和 1 mL亲和硅烷缓冲液 ,混匀。
B.3 .6 剥离硅烷工作液
分别量取 98 mL三氯甲烷溶液和 2 mL二甲基二氯硅烷溶液 ,混匀。
B.3 .7 10%过硫酸铵溶液
称取 1 .0 g过硫酸铵 ,溶于 10 mL去离子水中 ,混匀。 于 - 4 ℃保存
B.3 .8 1 × TBE 缓冲液
量取 500 mL 10 × TBE缓冲液(B.3 .1) ,用去离子水定容至 5 000 mL。
B.3 .9 6× 加样缓冲液
分别称取 0 .25 g溴酚蓝和 0 .25 g二甲苯青 ,分别加入 98 mL去离子甲酰胺和 1 mLEDTA溶液(pH 8 .0) ,搅拌溶解。
B.4 银染溶液的配制
B.4 .1 固定液
量取 100 mL冰醋酸 ,加入 1 000 mL去离子水。
B.4 .2 染色液
称取 2 .0 g硝酸银 ,溶于 1 000 mL去离子水中。
B.4 .3 显影液
称取 15 g氢氧化钠 ,溶于 1 000 mL去离子水中 ,再加入 5 mL 甲醛。
附录 C (规范性)引物及序列
引物及序列见表 C.1。
表 C.1 引物及序列
附录 D (资料性)
引物相关信息
引物相关信息见表 D.1。
表 D.1 引物相关信息
表 D.1 (续)
表 D.1 (续)
表 D.1 (续)
表 D.1 (续)
表 D.1 (续)
附录 E
(资料性)
参照品种相关信息
参照品种相关信息见表 E.1 和表 E.2。
表 E.1 二棱类型参照品种
表 E.2 六棱类型参照品种
附录 F (资料性)引物分组
引物分组见表 F.1。
表 F.1 引物分组
