中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4821—2025
猪繁殖障碍性病毒六重PCR检测方法
A hexa-plex PCR method for simultaneous detection of viruses
causing porcine reproductive disorders
2025-12-09 发布
2026-05-01 实施
中华人民共和国农业农村部发布
前言
本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .
请注意本文件的某些内容可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出 .
本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口 .
本文件起草单位 :江苏省农业科学院、贵州大学、扬州大学、常熟市畜禽屠宰检疫和城区动物防疫中心 .
本文件主要起草人 :谢星、郝飞、曾智勇、庞茂达、刘文博、冯志新、陈蓉、李洋静、张磊 .
引言
猪繁殖障碍疫病是一类以母猪和公猪繁殖性疾病为特征的传染病 , 引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔、畸形胎、产仔数低 ,母猪发情障碍、返情、不孕 ,公猪精液品质下降等 ,给生猪养殖造成严重经济损失 . 在猪场常发的病毒性繁殖障碍疫病中 , 以猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒 2型 (PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和日本脑炎病毒(JEV)等病原较为常见 . 这些病原感染所致的临床症状类似 ,且常呈混合感染 ,给疫病的临床诊断和净化造成较大困难 .
本文件针对 PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV 和 JEV 6 种病毒 ,建立一种在一个反应体系中可同时鉴别出 6 种病毒单一或混合感染的经济适用的多重 PCR检测方法 , 为临床准确检测提供标准化、规范化的操作方法 .
猪繁殖障碍性病毒六重 PCR检测方法
1 范围
本文件规定了猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒 2 型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和日本脑炎病毒的六重 PCR检测方法和操作程序 .
本文件适用于对引起猪繁殖障碍的病毒进行检测 .
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 . 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ; 不注日期的引用文件 , 其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 .
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件 .
3 .1
猪繁殖障碍性病毒 virusescausingporcinereproductivedisorders
可引起母猪、公猪繁殖障碍相关疾病的病毒 . 临床上 , 以猪伪狂犬病病毒 (PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒 2 型 (PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和日本脑炎病毒(JEV)6 种最为常见 .
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件 .
CSFV:猪瘟病毒(classical swine fever virus)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
JEV: 日本脑炎病毒(japanese encephalitis virus)
PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
PCV2 :猪圆环病毒 2 型 (porcine circovirus type2)
PPV:猪细小病毒(porcine parvovirus)
PRRSV:猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)
PRV:伪狂犬病病毒(pseudorabies virus)
RNA:核糖核酸(ribonucleic acid)
TCID50 :组织半数感染量(tissue culture infective dose 50%)
5 样品采集、处理、保存和运输
5 .1 仪器设备
5 .1 .1 高压或煮沸的剪刀、镊子、解剖刀具等解剖器材 .
5 .1 .2 组织匀浆机或研钵 .
5 .1 .3 超声波裂解仪 .
5 .1 .4 高速冷冻离心机 .
5 .2 试剂材料
5 .2 .1 PBS溶液 .
5 .2 .2 一次性无菌注射器(5 mL、10 mL)及针头 ;真空采血管 ;棉签 ;无菌离心管(2 mL、10 mL) ;无菌密
封袋或密封容器;工作服 ;一次性手套 ;采样记录单 ;记号笔 ; 防水标签 ;封口膜 ;冰袋 .
5 .3 样品采集和处理
5 .3 .1 样品采集
在样品采集处理过程中 ,应戴好一次性手套、口罩和防护帽 . 样品采集按 NY/T 541 规定的方法采样 ,各病原待检样品优先级按照表 1 .
表 1 临床样品采集列表
5 .3 .2 样品处理
5 .3 .2 .1 血清 :待 2 mL血液凝固后 ,取上清放于离心管中 ,4 ℃ 3 500 r/min离心取血清 .
5 .3 .2 .2 精液 :取精液 0 .5 mL,冻融 2 次或超声波裂解 ,10 000 r/min离心 10 min,取上清液 .
5 .3 .2 .3 组织 :取待检组织样本 2 .0 g 于灭菌的组织研磨器中充分研磨后 ,加入适量的 PBS溶液 ,制成混悬液 ,4 ℃ 3 000 r/min离心 15 min,取上清液转入无菌离心管中 ,对样本进行编号 .
5 .3 .2 .4 拭子 :拭子样品悬浮于 1 mL PBS溶液中 ,混匀成悬浮液 .
5 .3 .2 .5 实验室培养物 :取实验室培养物 0 .5 mL,冻融 3 次 ,10 000 r/min离心 10 min,取上清液 .
5 .3 .2 .6 流产胎儿、木乃伊胎的实质器官 :去掉表面筋膜 ,用研钵研碎 ,加入灭菌 PBS制成 1 : 5 的悬液 ,加入 1%青链霉素 ,4 ℃过夜处理 ,冻融 3 次 ,3 000 r/min离心 10 min,取上清液 .
5 .3 .2 .7 流产母猪的阴道分泌物 :用无菌棉拭子轻轻旋转插入流产母猪阴道 2 cm ~ 4 cm 刮取阴道内容物 , 阴道拭子放入离心管 ,用 2 mL灭菌 PBS浸润 ,反复挤压后 ,3 000 r/min离心 10 min,取上清液 .
5 .4 保存与运输
将采集的样品随冰袋或干冰一起放入送样箱 , 密封后 , 使用 75%酒精对送样箱表面进行消毒 , 于
作 . 如样品不能被及时送到实验室 ,应置于- 20 ℃以下保存 . 具体样品
6 六重 PCR方法
6 .1 仪器设备
6 .1 .1 生物安全柜 .
6 .1 .2 CO2 培养箱 .
6 .1 .3 - 70 ℃ 冰箱 .
6 .1 .4 高速冷冻离心机 .
6 .1 .5 自动化核酸提取仪 .
6 .1 .6 PCR仪 .
6 .1 .7 水平电泳槽 .
6 .1 .8 凝胶成像系统或紫外透射仪 .
6 .1 .9 冰箱 :2 ℃ ~ 8 ℃ 和 - 20 ℃ .
6 .1 .10 微量加样器(量程 :0 .5 μL~ 10 μL;2 μL~ 20 μL;20 μL~ 200 μL;100 μL~ 1 000 μL) .
6 .2 试剂材料
6 .2 .1 核酸染料、DNA相对分子量标准物 DL2000 .
6 .2 .2 商品化 DNA/RNA提取试剂盒 .
6 .2 .3 具有反转录和扩增功能的商品化一步法 RTGPCR试剂盒 .
6 .2 .4 六重 PCR 引物 ,引物序列及溶解方法按照附录 A 的规定执行 .
6 .2 .5 0 .01 mol/L PBS溶液(pH 7 .2 ~ pH 7 .4) ,配制方法按照附录 B 中 B.1 的规定执行 .
6 .2 .6 1 × TAE 电泳缓冲液(pH 8 .0) ,配制方法按照 B.2 的规定执行 .
6 .2 .7 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水 ,配制方法按照 B.3 的规定执行 .
6 .2 .8 6×上样缓冲液 ,配制方法按照 B.4 的规定执行 .
6 .2 .9 2%的琼脂糖凝胶 ,配制方法按照 B.5 的规定执行 .
6 .2 .10 参考毒株 :PRV(以 GZGZ1 株为例)、PPV(以 NJ株为例)、PCV2 (以 GZG RH1 株为例)、PRRSV
6 .2 .1 1 Vero细胞、BHKG21 细胞、ST 细胞、PKG 15 细胞和 MarcG 145 细胞生长液与维持液 .
6 .3 对照样品制备
6 .3 .1 阳性对照样品的制备 : 参考毒株 JEV 用 BHKG21 细胞培养 , PPV 和 CSFV 用 ST 细胞培养 ,
10 000 TCID50 /mL,将病毒含量一致的各参考毒株培养液按 1 ∶ 1 混合 ,56 ℃ 水浴 30 min灭活后- 20 ℃
..,离:r、2,63i-0和℃CG 145 细胞培养液
6 .3 .3 空白对照 :无 RNA酶双蒸水 ,56 ℃ 水浴 30 min灭活后- 20 ℃ 保存 .
6 .4 核酸提取
6 .4 .1 采用 DNA、RNA提取试剂盒提取临床样品、阳性对照、阴性对照中的病毒核酸 ,或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病毒核酸 .
6 .4 .2 对于精液样本 ,不适宜使用自动化核酸提取仪提取病毒核酸 ,可采用 DNA、RNA提取试剂盒 .
6 .5 六重 PCR扩增
6 .5 .1 反应体系配制
按照表 2 配制 50 μLPCR反应体系 , 阳性对照样品核酸分别用 6 种病毒单引物和混合引物进行 PCR,临床样品核酸用 6 种病毒混合引物进行 PCR.
表 2 PCR反应体系(总体积为 50 μL)
各种试剂添加完成后需充分混匀 ,瞬时离心 ,使反应液全部集中于管底 . 每次检测应设阴性对照和阳性对照 .
6 .5 .2 反应程序设置
50 ℃反转录 40 min;94 ℃ 预变性 5 min;94 ℃变性 30 s,56 .4 ℃退火 30 s,72 ℃ 延伸 30 s,35 个循环 ;72 ℃再延伸 10 min;2 ℃ ~ 8 ℃ 保存反应产物 .
6 .6 电泳检测
6 .6 .1 阳性对照样品
将 8 μL ~ 10 μL各病毒单引物 PCR扩增产物和 6 种病毒混合引物 PCR 产物加入含有核酸染料的2%的琼脂糖凝胶的各电泳孔中 ,设阴性及空白样品扩增对照孔 ; 另取 5 μL DNA 分子量标准物 DL2000加入到另一电泳孔中 . 使用 5 V/cm 电压进行电泳 ,待染料移行至凝胶 4/5 距离时 ,停止电泳 . 电泳后 ,在凝胶成像系统或紫外透射仪下观察结果 ,结果如附录 C 中的 C.1 ,则证明阳性对照成立 ,可以用于临床样品的检测 .
6 .6 .2 临床样品
选取临床发病活猪血清样品、濒死或病死剖杀猪肺脏样品进行单引物或多引物 PCR,设置阳性对照 . PCR产物按 6 .6 .1 进行电泳 ,观察结果 ,参照 C.2 .
实验室废弃物处理应按照 GB 19489 的规定执行 .
6 .7 实验成立的条件
阳性对照 :六种病毒扩增基因产物大小应符合表 A.1 扩增片段大小 .
阴性对照 :无相应条带出现 .
空白对照 :无相应条带出现 .
6 .7 .1 结果判定
6 .7 .1 .1 阴性结果
未出现大小约为 178 bp、271 bp、353 bp、433 bp、508 bp和 1 015 bp的特异性条带 ,判定 PRV、PPV、 PCV2、PRRSV、CSFV 和 JEV均为核酸阴性 .
6 .7 .1 .2 单独感染
仅出现大小约为 178 bp,且与阳性对照条带大小相符 ,判定被检样品中 PRV核酸阳性 ;
仅出现大小约为 271 bp,且与阳性对照条带大小相符 ,判定被检样品中 PPV核酸阳性 ;
仅出现大小约为 353 bp,且与阳性对照条带大小相符 ,判定被检样品中 PCV2 核酸阳性 ;
仅出现大小约为 433 bp,且与阳性对照条带大小相符 ,判定被检样品中 PRRSV核酸阳性 ;
仅出现大小约为 508 bp,且与阳性对照条带大小相符 ,判定被检样品中 CSFV核酸阳性 ;
仅出现大小约为 1 015 bp,且与阳性对照条带大小相符 ,判定被检样品中 JEV核酸阳性 .
6 .7 .1 .3 多重感染
同时出现表 A.1 中两种或两种以上特异性条带 ,且分别与对应阳性对照条带大小相符 ,判定为被检样品中同时含有相对应病毒核酸 .
若需进一步验证 ,可对 PCR扩增产物进行测序 ,并与已公开发表的相应特异性片段序列进行同源性
比对:,,、列、PoV、CSFV 和 JEV 的最低检出量分别为 2 .5 × 10 2
TCID50、3 .2 × 10 2 TCID50、5 × 10 3 TCID50、2 .4 × 10 3 TCID50、8 .8 × 10 2 TCID50 和 1 .0 × 10 2 TCID50 o
附录 A
(规范性)
六重 PCR检测方法引物信息
A.1 引物序列
用于六重 PCR检测的引物见表 A.1。
表 A.1 用于六重 PCR检测的引物
A.2 引物的溶解
引物 PPV P1、PPV P2、PCV2 P1、PCV2 P2、PRRSV P1、PRRSV P2、JEV P1、JEV P2 用灭菌的DEPC处理水溶解配制成浓度为 10 μmol/L;引物 PRV P1、PRV P2、CSFV P1、CSFV P2 用灭菌的 DEPC处理水溶解配制成浓度为 15 μmol/L。
附录 B (规范性)溶液的配制
B.1 0.01 mol/L PBS溶液(pH 7.2 ~ pH 7.4)
配制所需试剂为 :
a) 8 .00 g氯化钠(NaCl) ;
b) 0 .20 g氯化钾(KCl) ;
c) 0 .24 g磷酸二氢钾(KH2 PO4) ;
加入到 800 mL蒸馏水中溶解 ,加蒸馏水定容至 1L,调节溶液的 pH 至 7 .2 ~ 7 .4。分装后在 121 ℃
灭菌 15 min~ 20 min,或过滤除菌 ,保存于室温。
B.2 1×TAE 电泳缓冲液 (pH8 .0)
配制所需试剂为 :
a) 242 .0 g 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris) ;
b) 18 .60 g 乙二胺四乙酸二钠二水合物(Na2 EDTA ●2H2 O) ;
加入配制好的 100 mL 0 .5 mol/LEDTA(pH8 .0)溶解 ,用蒸馏水补足至 1 000 mL,并调溶液的 pH至 8 .0 ,充分混匀后即为 50×TAE,4 ℃ 保存备用 ;使用前用蒸馏水将其作 50 倍稀释即为 1×TAE,现用现配。
B.3 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水
用 0 .1%DEPC处理后的蒸馏水 ,经 121℃ 30 min高压灭菌 ,或者直接购买商品化无 DNA酶无 RNA酶的无菌水。
B.4 6×上样缓冲液
配制所需试剂为 :
a) 30 mmol/L 乙二胺四乙酸 ;
b) 36% (V/V) 甘油 ;
c) 0 .05%(W/V) 二甲苯氰 FF;
d) 0 .05% (W/V) 溴酚蓝。
4 ℃保存备用。 使用时 ,将 1 倍体积的 6 × DNA 上样缓冲液(含 SDS) 6 倍稀释后加入 5 倍体积的
上样缓冲液 ,按照说明书要求进行操作。
B.5 2%的琼脂糖凝胶
准确称取琼脂糖粉 2 g,加入到配置好的 1×TAE缓冲液中溶解 ,定容至 100 mL,加热融化加入新型核酸染料 ,倒入胶槽制备凝胶。
附录 C
(资料性)
六重 PCR检测电泳例图
C.1 六重 PCR检测标准毒株电泳例图
六重标准毒株电泳图如图 C.1 .
标引序号说明 :
M —DL2000DNA分子量标准 ; 4 —PCV2 核酸阳性 ;
N — 阴性对照 ; 5 —PRRSV核酸阳性 ; ;
P — 阳性对照 6 —CSFV核酸阳性 ;
1 — 空白对照 ; 7 —JEV核酸阳性 ;
2 —PRV核酸阳性 ; 8 — 空白对照 .
3 —PPV核酸阳性 ;
图 C.1 六重 PCR各毒株扩增结果电泳图
C.2 六重 PCR检测临床样品电泳例图
六重临床样品电泳图如图 C.2 .
标引序号说明 :
M —DL2000DNA分子量标准 ; 3 —PCV2、PRV核酸阳性(血清) ;
N — 阴性对照 ; 4 —PCV2、PRV、PRRSV核酸阳性(血清) ;
P — 阳性对照 ; 5 —PRRSV、PCV2 核酸阳性(肺脏) ;
1 — 空白对照 ; N1 — 空白对照 .
2 —PRV核酸阳性(血清) ;
图 C.2 六重 PCR 临床样品扩增结果电泳图
附录 D
(资料性)
六重 PCR扩增产物参考序列
D.1 伪狂犬病病毒(PRV)六重 PCR 目的 gE基因扩增序列
5 ,_CGGGGCATCGGCGACTACCTGCCGCCCGAGGTGCCGCGGCTCCAGCGCGAGCCGCCCAT
CGTCACCCCGGAGCGGTGGTCGCCGCACCTGACCGTCCGGCGGGCCACGCCCAACGACACGGG CCTCTACACGCTGCACGACGCCTCGGGGCCGCGGGCCGTGTTCTTTGTGGCGGTGG_3 ,
D.2 猪细小病毒(PPV)六重 PCR 目的 NS1 基因扩增序列
5 ,_GAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACACAACCAATAAGAGACAGAATGTTA AACATAAACCTAACCAGAAAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAACTGAATGGC CACTAATATGTGCTTGGTTGGTAAAGAAAGGTTACCAAGCAACAATGGCTAGCTATATGCA TCATTGGGGAAATGTACCTGATTGGTCAGAAAAATGGGAGGAGCCAAAAATGCAAACCCCA ATAAATACACCAACAGACTCTCAGATTTCCAC_3 ,
D.3 猪圆环病毒 2 型 (PCV2)六重 PCR 目的 ORF2 基因扩增序列
5 ,_AAGGGTTGGGGGATTGTATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGGTCATAGGTTTG GGCTGTGGCCTTTATTACAAAGTTGTCATCTAGAATAATAGCACTGGATCCAACTCCCCTGT CACCCTGGGTGATCGGGGAGCAGGGCCAGAATTCAACCTTAACCTTTCTTATTCTGTAGTAT TCAAAGGGTATAGAGATTTTGTTGGTCCCCCCTCCCGGGGGAACAAAGTCGTCAAGATTAAA TCTCAGCATGTCCACCGCCCAGGAGGGCGTGCTGACTGTGGTAGCCTTGACAGTATATCCGAA GGTGCGGGAGAGGCGGGCGTTGAAGATGCCATTTTTCCTTCTCCAGCG_3 ,
D.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)六重 PCR 目的 ORF7 基因扩增序列
5 ,_CCAGTTCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAGATGCTGGGTAAGATCATCGCTCAGCAA AACCAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGAAAGAAAAATAAGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCC ATTTTCCTCTAGCGACTGAAGATGATGTCAGACATCACTTTACCCCCAGTGAGCGGCAATTG TGTCTGTCGTCAATCCAGACCGCCTTTAATCAAGGCGCTGGGACTTGCACCCTGTCAGATTCA GGGAGGATAAGTTACACTGTGGAGTTTAGTTTGCCTACGCATCATACTGTGCGCCTGATCCG CGTCACAGCATCACCCTCAGCATGATGGGCTGGCATTCTTGAGGCATCTCAGTGTTTGAATT GGAAGAATGTGTGGTGAATGGCACTGATTGACATTGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATCGG GGC_3 ,
D.5 猪瘟病毒(CSFV)六重 PCR 目的 E2 基因扩增序列
5 ,_GCTCCTGGTTGGTAACCTCGGGACGGAGGTTGGGGATTTGGAGCATCTTGGCTGGGTG CTTAGAGGGCCCGCTGTCTGCAAGAAGGTTACTGAACATGAAAAGTGTACTACGTCTATAAT GGATAAGTTGACTGCTTTGTTCGGTGTTATGCCAAGAGGTACCACCCCCAGAGCTCCCGTAA GATTTCCCACCTCCTTCCTAAAGATAAGAAGAGGGCTGGAGACGGGTTGGGCTTACACACAC CAAGGCGGCATCAGCTCAGTTGACCATGTCACTTGTGGGAAAGACTTGCTGGTGTGTGACAC CATGGGTCGGACAAGGGTCGTCTGCCAATCAAACAATAAGATGACTGACGAGTCCGAATACG
GAGTCAAAACCGACTCAGGGTGCCCAGAGGGAGCCAGATGTTACGTGTTCAACCCTGAGGCA GTCAACATATCAGGCACTAAAGGGGCCATGGTCCACTTACAGAAAACTGGTGGAGAATTCAC CTGTGTAACAGCATCA_3 ,
D.6 日本脑炎病毒(JEV)六重 PCR 目的 E 基因扩增序列
5 ,_TGTGGACTTTTCGGGAAGGGAAGCATTGACACATGTGCAAAATTCTCCTGCACCAGT AAAGCGATTGGGAGAACAATCCAGCCAGAAAACATCAAATACGAAGTTGGCATTTTTGTGC ATGGAACCACCACTTCGGAAAACCATGGGAATTATTCAGCGCAAGTTGGGGCGTCCCAGGCG GCAAAGTTTACAGTAACACCCAATGCTCCTTCGATAACCCTCAAACTTGGTGACTACGGAGA AGTCACACTGGACTGTGAGCCAAGGAGTGGACTGAACACTGAAGCGTTTTACGTCATGACCG TGGGGTCAAAGTCATTTCTGGTCCATAGGGAGTGGTTTCATGACCTCGCTCTCCCCTGGACGT CCCCTTCGAGCACAGCGTGGAGAAACAGAGAACTCCTCATGGAATTTGAAGGGGCGCACGCC ACAAAACAGTCCGTTGTTGCTCTTGGGTCACAGGAAGGAGGCCTCCATCAGGCGTTGGCAGG AGCCATCGTGGTGGAGTACTCAAGCTCAGTGAAGTTAACATCAGGCCACCTGAAATGTAGGC TGAAAATGGACAAACTGGCTCTGAAAGGCACAACCTATGGCATGTGTACAGAAAAATTCTC GTTCGCGAAAAATCCGGTGGACACTGGTCACGGAACAGTTGTCATTGAACTCTCCTACTCTG GGAGTGATGGCCCCTGCAAAATTCCGATTGTTTCCGTTGCGAGCCTCAATGACATGACCCCCG TTGGGCGGCTGGTGACAGTGAACCCCTTCGTCGCGACTTCCAGTGCCAACTCAAAGGTGCTGG TCGAGATGGAACCCCCCTTCGGAGACTCCTACATCGTAGTTGGAAGGGGAGACAAGCAGATC AACCACCATTGGCACAAAGCTGGAAGCACGCTGGGCAAGGCCTTTTCAACAACTTTGAAGGG AGCTCAAAGACTGGCAGCGTTGGGCGACACAGCCTGGGACTTTGGCTCTATTGGAGGGGTCT
TCAACTCCATAGGAAGAGCCGTTCACC_3 ,
注 : 单下划线部分为引物序列 ,双下划线部分为因平衡引物的 GC含量以及退火温度添加或突变的碱基。
