中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4820—2025
猪丁型冠状病毒感染诊断技术
Diagnostic techniques for porcine deltacoronavirus disease
2025-12-09 发布
2026-05-01 实施
中华人民共和国农业农村部发布
前言
本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .
请注意本文件的某些内容可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出 .
本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)提出并归口 .
本文件起草单位 :河南农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、华中农业大学 .
本文件主要起草人 :胡慧、魏战勇、邵卫星、方六荣、郑兰兰、张红垒、张峰、夏璐、张越、祖少坡、袁晋、项玉强、靳晓慧、郭东辉 .
引言
猪丁型冠状病毒感染(porcine deltacoronavirus disease)是由猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,
PDCoV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病 , 临床上以 10 日龄内的仔猪发生腹泻、呕吐、脱水为主要
特征。 在仔猪腹泻样品中 ,PDCoV检出率高达 20% ~ 60%。该病一年四季均可发生 ,其中冬春季为高发
猪丁型冠状病毒感染诊断技术
1 范围
本文件规定了猪丁型冠状病毒感染的临床诊断、样品采集与处理 , 以及病毒分离与鉴定、间接免疫荧光试验(IFA)、TaqMan荧光定量 RT_qPCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)等实验室诊断方法的技术要求。
本文件适用于新生仔猪的猪丁型冠状病毒感染的诊断、检测、检疫、监测和流行病学调查。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ; 不注日期的引用文件 , 其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
NY/T 541—2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA:牛血清白蛋白(bovine serum albumin)
bp:碱基对(base pair)
CPE:致细胞病变效应(cytopathic effect)
Ct值 :循环阈值(cycle threshold)
cDNA:互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid)
DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)
DMEM :杜氏培养基(dulbecco’s modified eagle medium)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
ELISA:酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbentassay)
FITC:异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate)
IFA: 间接免疫荧光(indirectimmunofluorescence assay)
IgG:免疫球蛋白 G(immunoglobulin G)
LLC_PK1 细胞 :猪肾细胞(porcine kidney epithelial cells 1 ,LLC_PK1)
MEM :最低必需培养液(minimal essential medium)
OD:光密度(optical density)
PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)
PBST:含吐温__20 的磷酸盐缓冲液(phosphate_buffered saline with tween_20)
PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
PDCoV:猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus)
RNA:核糖核酸(ribonucleic acid)
RT_qPCR:反转录实时荧光定量 PCR(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction)
5 临床诊断
5 .1 易感动物
家猪是 PDCoV 的易感动物 ,各年龄段猪均可感染 ,主要危害 10 日龄以内的新生仔猪 .
5 .2 临床症状
发病仔猪以腹泻、呕吐、脱水为特征 . 粪便为黄色、灰黄色稀粪 ,严重可呈水样腹泻 ; 呕吐物多为白色未消化的凝乳状液体 ;发病仔猪精神萎靡不振、倦怠、畏寒 ;全身被毛杂乱、无光泽 ;食欲减退 ,病程后期严重脱水 ,体重下降明显 .
5 .3 病理变化
5 .3 .1 剖检病理变化 :感染仔猪胃内充满未消化的凝乳块 ; 十二指肠、空肠和回肠肠壁变薄 ,部分肠管扩张呈半透明状 ,充满大量黄色的液体 ;肠系膜充血严重 .
5 .3 .2 组织病理学变化 :十二指肠腺体减少 ,黏膜下层及肠壁变薄 ;空肠损伤最严重 ,肠绒毛大量脱落 ,黏膜下层增厚 ; 回肠肠绒毛变短、萎缩、脱落 ,杯状细胞减少 ,淋巴滤泡体积减小、数量减少 ;不同肠段绒毛高度与隐窝深度之比有不同程度的降低 .
5 .4 临床判定
5 .4 .1 新生仔猪出现 5 .2 的临床症状或 5 .3 的病理变化 ,可临床判定为 PDCoV感染疑似病例 .
5 .4 .2 进一步确诊应采集腹泻仔猪的血清、粪便、小肠组织及内容物等样品 . 如有可能 ,应同时采集同一流行病学单元内其他未见明显临床症状仔猪的血清、粪便、小肠组织及内容物进行实验室诊断 .
6 样品的采集与处理
6 .1 采样用具
6 .1 .1 器械 :解剖刀、剪刀、镊子、药匙、注射器及针头、组织匀浆器等 .
6 .1 .2 容器 :离心管、样品保存管等 .
6 .1 .3 个人防护用具 : 防护服、防护镜、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等 .
6 .1 .4 其他 :微孔滤器、采样单、记号笔、防水标签、封口膜、冰袋等 .
6 .2 试剂材料
6 .2 .1 DMEM .
6 .2 .2 青霉素 ,浓度为 10 000 IU/mL.
6 .2 .3 链霉素 ,浓度为 10 000 μg/mL.
6 .3 样品采集
6 .3 .1 组织样品 :用无菌剪刀剪取发病仔猪的小肠组织 0 .5 g~ 1 .0 g 组织作为待检样品 , 放置于离心管 .
6 .3 .2 粪便及肠内容物样品 :用无菌的药匙 ,刮取新鲜粪便及肠内容物 ,放置于离心管 .
6 .3 .3 血液样品 :用无菌注射器采集发病猪或感染猪血液 .
6 .4 样品处理
6 .4 .1 组织样品 : 采集的肠组织 (经剪碎处理) , 按 1 ∶ 5 的比例加入终浓度为 100 IU/mL 青霉素、 100 μg/mL链霉素的 DMEM细胞培养液 ,反复研磨至糊状 ,将研磨好的病料反复冻融 3 次 ,4 ℃ 3 000 r/min离心 20 min,上清液用 0 .22 μm 微孔滤器过滤 ,收集样品滤液 .
6 .4 .2 粪便及肠内容物样品 :采集的粪便或肠内容物 ,按 1 ∶ 5 的比例加入终浓度为 100 IU/mL青霉素、 100 μg/mL链霉素的 DMEM 细胞培养液 ,振荡混匀 ,4 ℃ 3 000 r/min离心 20 min,上清液用 0 .22 μm 微孔滤器过滤 ,收集样品滤液 .
6 .4 .3 血液样品 :采集的猪血液(不加抗凝剂)室温下静置 2 h,3 000 r/min离心 10 min,收集血清 .
6 .5 存放与运输
采集的样品与冰块或干冰一起放入保温箱密封 ,在保温箱外喷洒消毒液 ,立即送到实验室检测。 处理
后样品在 4 ℃ ~ 8 ℃ 条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存 ,应放置于- 80 ℃ 冰箱 ,避免反复冻融。
7 病毒分离与鉴定
7 .1 仪器设备
7 .1 .1 生物安全柜。
7 .1 .2 恒温 CO2 培养箱。
7 .1 .3 显微镜。
7 .1 .4 台式低温高速离心机。
7 .1 .5 漩涡振荡器。
7 .1 .6 可调微量移液器(10 μL、200 μL、1 000 μL等不同规格)。
7 .2 试剂材料
7 .2 .1 PBS,按照附录 A 中的 A.1 配制。
7 .2 .2 细胞培养溶液 ,按照 A.2 配制。
7 .2 .3 细胞维持溶液 ,按照 A.3 配制。
7 .3 病毒分离
7 .3 .1 在 6 孔细胞培养板中接种 LLC_PK1 细胞悬液 ,置于 37 ℃ 5% CO2 培养箱中培养 ,约 24 h后细胞长至单层。
7 .3 .2 弃去细胞培养溶液 ,PBS洗 2 遍 ,每孔加入 400 μL 6 .4 的样品滤液 ,37 ℃ 5% CO2 培养箱吸附 1 h后 ,弃去未吸附的样品 ,PBS洗 2 遍。
7 .3 .3 每孔加入 2 mL含 5μg/mL胰酶的细胞维持溶液 ,37 ℃ 5% CO2 培养箱中培养 ,逐日观察细胞病变情况。
7 .3 .4 若出现细胞病变 ,待 60%细胞脱落时 ,将细胞培养板放置- 80 ℃ 冰箱 ,反复冻融次 , 收集病毒
7 .4 结果判定
7 .4 .1 PDCoV感染 LLC_PK1 细胞的 CPE主要表现为细胞变圆、聚集、皱缩 , 最后脱落(见附录 B 中的
B.1)。若病料接种孔的细胞出现 CPE或盲传后出现 CPE,细胞对照孔正常 ,并经第 8 章或第 9 章检测为
阳性 ,判定为 PDCoV分离阳性。
7 .4 .2 首次接种样品和盲传后均无 CPE,或出现 CPE但经第 8 章或第 9 章检测为阴性 ,判为 PDCoV分离阴性。
8 间接免疫荧光试验( IFA)
8 .1 仪器设备
8 .1 .1 生物安全柜。
8 .1 .2 恒温 CO2 培养箱。
8 .1 .3 倒置荧光生物显微镜。
8 .1 .4 台式低温高速离心机。
8 .1 .5 可调微量移液器(10 μL、200 μL、1 000 μL等不同规格)。
8 .2 试剂材料
8 .2 .1 PBS、细胞培养溶液、细胞维持溶液 , 同 7 .2。
8 .2 .2 PBST,按照 A.4 配制。
8 .2 .3 无水乙醇。
8 .2 .4 FITC荧光标记的抗猪 IgG。
8 .3 感染细胞的制备
8 .3 .1 在 6 孔细胞培养板中接种 LLC_PK1 细胞悬液 ,置于 37 ℃ 5% CO2 培养箱中培养 ,约 24 h后细胞长至单层。
8 .3 .2 弃去细胞培养溶液 ,PBS洗 2 遍。将第 7 章分离得到的样品接种于 6 孔细胞培养板中(400 μL/
8 .3 .3 加入含 5 μg/mL胰酶的细胞维持溶液(2 mL/孔) ,置于 37 ℃ 5% CO2 培养箱中培养 ,观察细胞病变。
8 .3 .4 同时设置阳性对照孔(接种 100 TCID50 /孔的 PDCoV 病毒液)和阴性对照孔(加入 400 μL含 5 μg/mL胰酶的细胞维持溶液)。
8 .4 感染细胞的固定
8 .4 .1 当细胞病变达 30% ~40%时 ,弃去细胞维持溶液 ,PBS洗 2 遍 ,缓慢加入预冷的无水乙醇(2 mL/孔) ,4 ℃ 放置 6 h。
8 .4 .2 PBS洗 2 遍 ,加入 5%(W/V)BSA封闭液(2 mL/孔) ,37 ℃ 封闭 2 h。
8 .5 间接荧光抗体染色
8 .5 .1 弃去 BSA封闭液 ,加入 PDCoV 标准阳性血清(用 1% BSA 进行 1 ∶ 100 稀释) , 300 μL/孔 ,4 ℃放置 12 h。
8 .5 .2 弃去 PDCoV标准阳性血清 ,PBST洗 5 遍 ,每遍 5 min。
8 .5 .3 加入 FITC荧光标记的抗猪 IgG(PBS 1 ∶ 100 稀释)300 μL/孔 ,37 ℃ 放置 50 min(避光操作)。
8 .5 .4 弃去 FITC荧光标记的抗猪 IgG,PBST洗 5 遍 ,每遍 5 min。
8 .5 .5 加入抗荧光衰减封片剂(300 μL/孔) ,荧光显微镜下观察荧光(避光操作)。
8 .6 结果判定
8 .6 .1 试验成立条件 : 当阳性对照孔出现特异性绿色荧光(见附录 B 中的 B.2) , 阴性对照孔未出现特异性绿色荧光时 ,试验成立。
8 .6 .2 在试验成立的条件下 ,待检样品出现特异性绿色荧光 ,判定该样品 PDCoV 阳性 ;未出现特异性绿色荧光 ,判定该样品 PDCoV 阴性。
9 TaqMan荧光定量 RTGqPCR检测
9 .1 仪器设备
9 .1 .1 荧光定量 PCR仪。
9 .1 .2 台式高速冷冻离心机。
9 .1 .3 可调微量移液器(10 μL、200 μL、1 000 μL等不同规格)。
9 .2 试剂材料
9 .2 .1 TRIZOL。
9 .2 .2 氯仿。
9 .2 .3 异丙醇。
9 .2 .4 商品化反转录试剂盒。
9 .2 .5 商品化探针法荧光定量 PCR酶混合物(2×premix Ex Taq)。
9 .3 样品总 RNA提取
TRIZOL法 :取被检样品 200 μL,加入 700 μLTRIZOL,混匀后 ,室温放置 10 min;加入氯仿 140 μL,
,℃,4 00mrim离in心离nm;弃in上;,L6 入(,,N
沉淀 ,4 ℃ 5 000 r/min离心 5 min;弃上清 ,室温干燥 5 min,加入无核酸酶水 20 μL,使充分溶解 .
注 : 也可采用 RNA提取试剂盒 ,选择市售商品化 RNA提取试剂盒 ,按照说明书提取 RNA.
9 .4 反转录
选择市售商品化反转录试剂盒 ,按照说明书进行反转录 ,获取 cDNA.
9 .5 荧光定量 PCR检测
9 .5 .1 引物与探针
引物和探针(序列见附录 C 中的 C.1)用 DEPC水配制成 100 μmol/L的储存浓度和 10 μmol/L工作浓度 .
9 .5 .2 荧光定量 PCR反应体系的配制
在反应混合物配制区进行 . 设所需 PCR样品数为 n,n=待检样品数+阳性对照(2 孔)+阴性对照
(在扩增反应阶段设置 , 以无核酸酶水作为模板) . 样品测试反应体系配制见 C.2 .
9 .5 .3 荧光定量 PCR扩增反应条件
第一阶段 ,预变性 95 ℃ 30 s.
第二阶段 ,变性 95 ℃ 5 s,退火延伸 60 ℃ 30 s, 40 个循环 . 在第二阶段每个循环的 60 ℃ 时收集
荧光 .
9 .6 结果判定
9 .6 .1 试验成立条件 :空白对照无 Ct值并且无扩增曲线 , 阴性对照无 Ct值或 Ct值 ≥40 , 阳性对照的 Ct值应 ≤30 ,并出现典型的扩增曲线 ,此次试验有效 ;否则 ,此次试验视为无效 .
9 .6 .2 被检样品 Ct值 ≤35 且出现典型的扩增曲线 ,判为阳性 ; 当无 Ct值或 Ct值 ≥40 ,判为阴性 ; 当 35
10 酶联免疫吸附试验(ELISA)
10 .1 仪器设备
10 .1 .1 酶联免疫测定仪 .
10 .1 .2 洗瓶或洗板机 .
10 .1 .3 37 ℃ 恒温箱 .
10 .1 .4 可调微量移液器(10 μL、200 μL、1 000 μL等不同规格) .
10 .2 试剂材料
10 .2 .1 包被液 ,按照附录 D 中的 D.1 配制 .
10 .2 .2 洗液 , 即 PBST溶液 ,配制方法同 A.4 .
10 .2 .3 封闭液 ,按照 D.2 配制 .
10 .2 .4 样品/酶标抗体稀释液 ,按照 D.3 配制 .
10 .2 .5 终止液 ,按照 D.4 配制 .
10 .2 .6 商品化的 HRP标记山羊抗猪 IgG.
10 .2 .7 商品化显色液 TMB.
10 .2 .8 对照 : 阳性对照血清、阴性对照血清 .
10 .3 抗原包被
用包被液将重组 PDCoV N 蛋白抗原稀释终浓度至 1 μg/mL,加入 96 孔酶标板中(100 μL/孔) ,4 ℃包被 16 h.
10 .4 洗涤
弃掉 96 孔酶标板中液体 ,用洗液洗 3 遍 ,每遍 3 min。在滤纸上吸干孔内残液。
10 .5 封闭
每孔加入封闭液 200 μL,37 ℃ 孵育 2 h,洗涤同 10 .4。
10 .6 加样
待检血清用样品稀释液作 80 倍稀释后 ,加入 96 孔酶标板中 ,每孔 100 μL。 每块反应板设阳性对照
h,洗涤同 10 .4。
10 .7 加酶标抗体
用酶标抗体稀释液将 HRP标记的羊抗猪 IgG抗体作 6 000 倍 ~ 8 000 倍稀释 ,每孔加入 100 μL,37 ℃ 作用 1 h,洗涤同 10 .4。
10 .8 加显色液
每孔加入显色液 100 μL,37 ℃ 避光作用 10 min。
10 .9 终止反应
每孔加入 50 μL终止液 ,15 min内用酶联免疫测定仪在 450 nm 波长测定每孔的光密度(OD450 值)。
10 .10 结果判定
10 .10 .1 试验成立条件 : 阳性血清对照孔平均 OD450 值 >1 .0 , 阴性血清对照孔平均 OD450 值 ≤0 .1 为正常反应 ;否则 ,应重新进行试验。
10 .10 .2 在试验成立的条件下 ,若 OD450 值 ≥0 .3 则判定为 PDCoV 抗体阳性; OD450 值 <0 .3 则判定为PDCoV抗体阴性。
1 1 综合判定
1 1 .1 依据临床症状和病理变化可做出初步诊断 ,符合 5 .2 或 5 .3 的任何一项 , 可判为疑似猪丁型冠状病毒感染。 未免疫 PDCoV灭活疫苗的疑似病例猪只 ,经第 8 章、第 9 章或第 10 章任一项目检测为 PD_ CoV 阳性的 ,可诊断为猪丁型冠状病毒感染 ;疑似病例的免疫猪 ,经第 8 章或第 9 章检测为 PDCoV 阳性的 ,可判定为猪丁型冠状病毒感染。
1 1 .2 临床无明显特异症状的猪 ,如未免疫 PDCoV灭活疫苗 ,经第 8 章或第 9 章检测为 PDCoV 阳性的 ,
可判定为 PDCoV感染 ;经第 10 章检测为 PDCoV 阳性的 ,可判定为曾经感染过 PDCoV。如免疫过 PD_
CoV灭活疫苗 ,经第 8 章或第 9 章检测为 PDCoV 阳性的 ,可判定为 PDCoV感染。
附录 A
(规范性)
病毒分离和间接免疫荧光试验相关溶液的配制
A.1 0.01 mol/L PBS(pH 7.2)
0 .2 mol/L磷酸二氢钠水溶液 :磷酸二氢钠(NaH2 PO4 . H2 O)27 .6 g,先用适量蒸馏水溶解 ,最后定容至 1 000 mL。
0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液 :磷酸氢二钠(Na2 HPO4 .7H2 O)53.6 g(或 Na2 HPO4 . 12H2 O 71 .6 g,或Na2 HPO4 . 2H2 O 35 .6 g) ,先用适量蒸馏水溶解 ,最后定容至 1 000 mL。
0 .01 mol/L pH7 .2 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 的配制 : 取 0 .2 mol/L磷酸二氢钠水溶液 14 mL、 0 .2 mol/L磷酸氢二钠水溶液 36 mL、氯化钠 8 .5 g,调节至 pH 7 .2 ,然后用蒸馏水定容至 1 000 mL。 A.2 细胞培养溶液
加入 10%犊牛血清的 MEM 培养基(含 100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素 ,pH7 .2)。
A.3 细胞维持溶液
MEM 培养基(含 100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素 ,pH7 .2)。
A.4 PBST溶液
准确量取 PBS溶液 999 .5 mL、Tween_20 0 .5 mL,混匀。
附录 B
(资料性)
PDCoV细胞病变和间接免疫荧光结果判定参照图
B.1 正常 LLCGPK 细胞和 PDCoV感染后 CPE参照图
1 .1 PDCoV感染 LLC_PK1 细胞的 CPE主要表现为细胞变圆、聚集、皱缩 ,最后脱落 ,正常细胞和感染后细胞对比图如图 B.1。
图 B.1 正常 LLC_PK 细胞和 PDCoV感染后 CPE参照图
B.2 免疫荧光法 PDCoV感染阴性与阳性参考图
间接免疫荧光试验中 PDCoV感染 LLC_PK1 细胞阳性孔出现特异性绿色荧光 , 阴性对照孔未出现特异性绿色荧光。 免疫荧光法 PDCoV感染阴性与阳性参考图如图 B.2。
图 B.2 免疫荧光法 PDCoV感染阴性与阳性参考图
附录 C
(资料性)
TaqMan荧光定量 RTGqPCR检测引物探针序列信息和反应体系
C.1 TaqMan荧光定量 RTGqPCR检测引物探针序列信息
猪丁型冠状病毒 TaqMan荧光定量 PCR 引物和探针序列见表 C.1。
表 C.1 引物和探针序列信息
C.2 TaqMan荧光定量 RTGqPCR检测反应体系
猪丁型冠状病毒 TaqMan荧光定量 RT_qPCR反应体系试剂配制见表 C.2。
表 C.2 RT_qPCR检测反应体系
附录 D
(规范性)
酶联免疫吸附试验相关溶液的配制
D.1 包被液
Na2 CO3 1 .59 g,NaHCO3 2.93 g,加蒸馏水至 950 mL,调节至 pH 9 .6 ,然后用蒸馏水定容至 1 000 mL.
D.2 封闭液
称取 2 .0 g 牛血清白蛋白(BSA) ,加入 100 mL PBS溶液 ,充分溶解 .
D.3 样品/酶标抗体稀释液
称取 1 .0 g 牛血清白蛋白(BSA) ,加入 100 mL PBS溶液 ,充分溶解 .
D.4 终止液(1 mol/L H2 SO4)
取浓硫酸 5 .5 mL,缓慢加入 94 .5 mL蒸馏水中 ,混匀 .
