中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2469—2025代替 NY/T 2469—2013
陆地棉品种鉴定 SSR分子标记法
Identification of upland cotton varieties—SSR marker method
2025-12-09 发布
2026-05-01 实施
中华人民共和国农业农村部发布
前言
本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草。
本文件代替 NY/T 2469—2013« 陆地棉品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法»。 与 NY/T 2469 — 2013 相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :
a) 增加了 JNC01 (A01 染色体)、JNC02(A01 染色体)、NAU0895 (A02 染色体)、HAU1413 (A03 染色体)、MUCS101 (A04 染色体)、NAU2026 (A05 染色体)、HAU0878 (A05 染色体)、JNC03 (A06染色体)、BNL1694 (A07 染色体)、SHIN_0376 (A07 染色体)、BNL3257 (A08 染色体)、JNC04 (A08 染色体)、NAU1369 (A08 染色体)、BNL1231 (A11 染色体)、NAU1233 (A11 染色体)、 BNL3261 (A12 染色体)、JNC05(A12 染色体)、JESPR0153 (A13 染色体)、JNC06 (D02 染色体)、 JNC07(D03 染色体)、CGR6410(D04 染色体)、DPL0071 (D05 染色体)、HAU2022 (D06 染色体)、 JESPR0292(D07 染色体)、NAU3100(D09 染色体)、BNL3948(D10 染色体)、DPL0376 (D11 染色体)、CIR170(D12 染色体)、JNC08(D12 染色体)、CIR216 (D13 染色体) 30 对引物及相应的等位变异和参照品种 ;
b) 删除了 BNL946、BNL3140、BNL3474、BNL3502、CIR246、DPL135、DPL209、DPL249、DPL442、 DPL513、DPL910、Gh112、Gh243、MUSS138、MUSS440、NAU943、NAU1093、NAU1190、 NAU1200、NAU1225、NAU2173、NAU3225、NAU3519、NAU3901、NAU5433、NAU5434、 TMB31227 对引物及相应的等位变异和参照品种。
本文件由农业农村部种业管理司提出。
本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC 277)归口。
本文件起草单位 : 山东省农业科学院作物研究所、农业农村部科技发展中心、新疆农科院种质资源研究所、江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所。
本文件主要起草人 :郑永胜、王丽媛、李汝玉、张晗、韩瑞玺、王穆穆、王威、王晖、王艳平、王东建、王晨宇、刘宁、王显生。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :
— 2013 年首次发布为 NY/T 2469—2013 ;
— 本次为第一次修订。
陆地棉品种鉴定 SSR分子标记法
1 范围
本文件规定了利用简单重复序列(SSR)进行陆地棉(Gossypium hirsutum L.) 品种鉴定的原理、主要仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息及使用、参照品种及使用、操作程序、结果判定与表述。
本文件适用于陆地棉品种的 DNA分子数据采集和品种鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ; 不注日期的引用文件 , 其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 3543 .2 农作物种子检验规程第 2 部分 :扦样
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 2594 植物品种鉴定 DNA分子标记法总则
3 术语和定义
NY/T 2594 界定的术语和定义适用于本文件。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
APS:过硫酸铵(ammonium persulphate)。
bp:碱基对(base pair)。
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)。
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy_ribonucleoside triphosphates)。
PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis)。
SSR:简单重复序列(simple sequence repeat)。
Taq 酶 :耐热 DNA聚合酶 (Taq_DNA polymerase)。
TBE:三羟甲基氨基甲烷硼酸盐乙二胺四乙酸(Tris_borate_EDTA)。
TEMED: 四甲基乙二胺(N ,N ,N′,N′_tetramethylethylenediamine)。
Tris:三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methylaminomethane THAM]。
5 原理
陆地棉品种基因组存在着大量能够稳定遗传的 SSR 标记 , 不同陆地棉品种在同一 SSR 的重复次数存在差异 ,这种差异可通过 PCR扩增及电泳方法进行检测 ,进而区分不同的陆地棉品种。
6 主要仪器设备及试剂
7 溶液配制
溶液配制方法见附录 B.
8 引物信息及使用
引物及序列见附录 C,引物相关信息见附录 D. 利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时选择普通引物 ;利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物 ,荧光标记位于正向引物 5 ′端 ,推荐的荧光标记见附录 D.可利用附录 C 中的引物序贯检测 , 当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品不同时 ,停止检测 .
9 参照品种及使用
参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异 ,宜与送检样品同时检测 ,参照品种相关信息见附录 E.
10 操作程序
10 .1 样品准备
送检样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官 . 种子样品需扦样时 ,应符合 GB/T 3543 .2 的要求 . 每份样品不少于 30 个个体 ,等量混合分析 ,必要时进行个体检测 .
10 .2 DNA提取
取混合样本约 200 mg,置于 2 .0 mL 圆底离心管中 ,液氮冷冻后充分研磨 ; 每管加入 600 μL预热到
65 ℃的 CTAB 提取液 ,充分混合 ,65 ℃水浴 45 min~60 min,每隔 15 min轻缓颠倒混匀 ,水浴后 12 000 r/min离
心 10 min. 吸取上清液转移至新的离心管中 ,每管加入等体积的三氯甲烷和异戊醇混合液 ,轻缓混匀后
静置 10 min,12 000 r/min离心 10 min. 吸取上清液转移至新的离心管中 ,加入等体积预冷的异丙醇 ,轻
轻颠倒混匀 , - 20 ℃放置 30 min,DNA沉淀后 12 000 r/min离心 10 min. 弃上清液 ,用体积分数为 70%
度 , 210: .DNA提取方法 ,DNA质量能够满足 PCR扩增要求的其他 DNA提取方法均适用于本文件 . DNA
溶液的紫外吸光度 OD260 与 OD280 的比值宜介于 1 .7 ~ 2 .0 .
注 2 :三氯甲烷和异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为 24 ∶ 1 .
10 .3 PCR扩增
10 .3 .1 反应体系
PCR扩增反应体系的总体积和各组分的终浓度参照表 1 配制 ,可以依据试验条件调整 .
表 1 PCR扩增反应体系
10 .3 .2 反应程序
推荐反应程序 : 94 ℃预变性 5 min; 94 ℃变性 30 s, 57 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 45 s,共 35 个循环 ; 72 ℃延伸 10 min,产物 4 ℃保存 .
反应程序中各反应参数可根据 PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而做适当的调整 .
10 .4 PCR产物电泳
10 .4 .1 垂直板变性 PAGE
10 .4 .1 .1 制胶
硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上 ,将 0 .5 mL剥离硅烷工作液均匀涂在带凹槽的短玻璃板上。 操作过程
上凹槽短玻璃板 , 用夹子固定 , 用水平仪调平。 取 100 mL 质量分数为 6%的变性 PAGE 胶溶液 , 加入
50 μL四甲基乙二胺(TEMED)和 500 μL质量分数为 10%的过硫酸铵(APS) ,迅速混匀 ,将胶灌入玻璃
胶室 ,灌胶过程中应防止出现气泡。 待胶室灌满后 ,在凹槽处将 0 .4 mm 厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻插
入胶液约 4 mm ,室温聚合 1 h 以上 ,胶聚合后 ,清理胶板表面溢出的胶液 ,轻轻拔出梳子 ,用水洗净备用。
10 .4 .1 .2 变性
在 20 μLPCR产物中加入 4 μL 6 × 加样缓冲液 ,混匀。 在 PCR扩增仪上运行 95 ℃变性 5 min,4 ℃
冷却 10 min以上备用。
10 .4 .1 .3 电泳
将胶板安装于电泳槽上 ,在电泳正极槽和负极槽各加入 600 mL 的 1 × TBE缓冲液 ,使其没过电极
线。 1 800V恒压预电泳 10 min~ 20 min。用移液器吹吸加样槽 ,清除气泡和杂质。 将样品梳(鲨鱼齿朝
范围的 , 电泳参考时间分别为 1 .5 h、2 .0 h、2 .5 h、3 .5 h, 当等位变异碱基对数差异较小时 ,可适当延长电
泳时间。 电泳结束后关闭电源 ,取下玻璃板并轻轻撬开 ,凝胶附着在长玻璃板上。
10 .4 .1 .4 染色
将附着凝胶的长玻璃板胶面向上浸入固定液中 ,轻轻晃动 3 min后取出 ,在双蒸水中快速漂洗 , 时间不超过 10 s;将胶板放入染色液中 ,轻轻晃动 5 min~ 10 min后取出 ,在双蒸水中快速漂洗 ,时间不超过 10 s;将胶板放入显影液中 ,轻摇晃动待条带清晰后取出 ,再迅速放入固定液中定影 5 min取出 ,在双蒸水中漂洗 1 min;取出胶板 , 晾干 ,放在胶片观察灯上观察 ,记录结果 ,拍照保存。
注 : 固定液、染色液、双蒸水和显影液的用量 , 以淹没胶面为准。
10 .4 .2 荧光毛细管电泳
10 .4 .2 .1 PCR产物样品准备
根据预先确定的引物分组(见附录 F) ,分别取等体积不同荧光标记的扩增产物 ,混匀稀释。 吸取 1 μL
混合液加入 DNA分析仪配套上样板中。
注 :稀释倍数通过荧光毛细管电泳预实验确定。
10 .4 .2 .2 变性
上样板各孔分别加入 0 .1 μL分子量内标和 8 .9 μL去离子甲酰胺 , 在 PCR 扩增仪上 95 ℃变性5 min,取出后立即置于冰上 ,冷却 10 min以上 ,瞬时离心 10 s后备用。
10 .4 .2 .3 电泳
按照 DNA分析仪操作手册电泳 ,并保存电泳原始数据文件。
10 .5 数据分析
10 .5 .1 等位变异确定与记录
位点扩增片段的迁移位置与对应的参照品种进行比较 ,确定送检样品在该位点的等位变异。 对于荧光毛
细管电泳 ,通过参照品种消除不同批次或者不同型号 DNA分析仪可能存在的系统误差 ,使用片段分析软
件读取送检样品在该位点的等位变异。
纯合位点的等位变异数据记录为 X/X ,杂合位点的等位变异数据记录为 X/Y,其中 X、Y 分别为该位点上的 2 个等位变异 ,小片段数据在前 ,大片段数据在后 . 缺失位点的等位变异数据记录为 0/0 .
示例 1 :样品在某个位点上仅出现 1 个等位变异 ,为 160 bp,则该位点的等位变异数据记录为 160/160 .
示例 2 :样品在某个位点上有 2 个等位变异 ,分别为 160 bp、165 bp,则该位点的等位变异数据记录为 160/165 .
10 .5 .2 数据比对与差异位点统计
逐一比对送检样品与对照样品每个位点的等位变异数据 ,按照位点相同、位点差异、数据缺失、无法判定情形 ,记录每个位点的比对结果 ,统计检测位点数和差异位点数 .
1 1 结果判定与表述
1 1 .1 判定规则
当差异位点数大于 4 ,判定为 “不同 ”; 当差异位点数小于等于 4 ,判定为 “疑同 ”.
1 1 .2 结果表述
送检样品与对照样品 (或对照样品指纹)采用检测 ,检测位点数为 ,差异位点数为 ,判定为 .
附录 A
(规范性)
主要仪器设备及试剂
A.1 主要仪器设备
A.1 .1 PCR扩增仪。
A.1 .2 高压电泳仪 :最高电压不低于 2 000 V,具有恒电压、恒电流和恒功率功能。
A.1 .3 垂直电泳槽及配套的制胶附件。
A.1 .4 离心机。
A.1 .5 水平摇床。
A.1 .6 胶片观察灯。
A.1 .7 电子天平 :感量为 0 .1 g 和 0 .01 g。
A.1 .8 微量移液器 :规格分别为 10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL,连续可调。
A.1 .9 磁力搅拌器。
A.1 .10 核酸浓度测定仪或超微量紫外分光光度计。
A.1 .1 1 微波炉。
A.1 .12 高压灭菌锅。
A.1 .13 酸度计。
A.1 .14 水浴锅。
A.1 .15 低温冰箱。
A.1 .16 制冰机。
A.1 .17 凝胶成像系统或紫外透射仪。
A.1 .18 DNA分析仪 :基于毛细管电泳 ,有片段分析功能和数据分析软件 ,最低分辨率 1 bp。
A.1 .19 其他相关仪器和设备。
A.2 主要试剂
除非另有说明 ,均使用分析纯试剂。
A.2 .1 十六烷基三甲基溴化铵[CTAB,C16 H33 (CH3) 3 NBr,CAS号 :57__09__0]。
A.2 .2 三氯甲烷(CHCl3 ,CAS号 :67__66__3)。
A.2 .3 异戊醇(C5 H12 O,CAS号 :123__51__3)。
A.2 .4 异丙醇[(CH3) 2 CHOH ,CAS号 :67__63__0]。
A.2 .5 乙二胺四乙酸二钠二水合物(Na2 EDTA . 2H2 O,C10 H18 N2 Na2 O10 ,CAS号 :6381__92__6)。
A.2 .6 三羟甲基氨基甲烷(Tris,C4 H11 NO3 ,CAS号 :77__86__1)。
A.2 .7 浓盐酸(HCl,CAS号 :7647__01__0)。
A.2 .8 氢氧化钠(NaOH ,CAS号 :1310__73__2)。
A.2 .9 10 × PCR缓冲液 :含 Mg2 + 25 mmol/L。
A.2 .10 4 种脱氧核糖核苷酸 :dATP、dTTP、dGTP、dCTP。
A.2 .1 1 SSR 引物。
A.2 .12 氯化钠(NaCl,CAS号 :7647G 14G 5) .
A.2 .13 Taq DNA聚合酶(Taq酶 ,CAS号 :9012G 90G2) .
A.2 .14 DNA Marker:DNA 片段分布范围在 50 bp~ 500 bp.
A.2 .15 甲酰胺(CH3 NO,CAS号 :75G 12G 7) .
A.2 .16 溴酚蓝(C19 H10 Br4 O5 S,CAS号 :115G39G 9) .
A.2 .17 二甲苯青(C25 H27 N2 NaO6 S2 ,CAS号 :2650G 17G 1) .
A.2 .18 甲叉双丙烯酰胺[(H2 C=CHCONH) 2 CH2 ,CAS号 :110G26G 9] . A.2 .19 丙烯酰胺(C3 H5 NO,CAS号 :79G06G 1) .
A.2 .20 硼酸(H3 BO3 ,CAS号 :10043G35G3) .
A.2 .21 尿素(CH4 N2 O,CAS号 :57G 13G 6) .
A.2 .22 亲和硅烷 .
A.2 .23 二甲基二氯硅烷(C2 H6 Cl2 Si,CAS号 :75G 78G 5) .
A.2 .24 无水乙醇(C2 H6 O,CAS号 :64G 17G 5) .
A.2 .25 四甲基乙二胺(TEMED,C6 H16 N2 ,CAS号 :110G 18G 9) .
A.2 .26 过硫酸铵[APS, (NH4) 2 S2 O8 ,CAS号 :7727G 54G0] .
A.2 .27 冰醋酸(CH3 COOH ,CAS号 :64G 19G 7) .
A.2 .28 硝酸银(AgNO3 ,CAS号 :7761G88G8) .
A.2 .29 甲醛(HCHO,CAS号 :50G00G0) .
A.2 .30 DNA分析仪用丙烯酰胺胶液 .
A.2 .31 DNA分析仪用分子量内标 .
A.2 .32 DNA分析仪用电泳缓冲液 .
A.2 .33 DNA分析仪用光谱校准基质 .
附录 B (规范性)溶液配制
试剂配制用水应符合 GB/T 6682 的要求。
B.1 DNA提取溶液的配制
B.1 .1 0.5 mol/L EDTA 溶液
称取 186 .1 g Na2 EDTA . 2H2 O 溶于 800 mL水中 ,充分搅拌溶解 ,加 NaOH 调 pH 至 8 .0 ,加水定容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
B.1 .2 0.5 mol/L HCl溶液
量取 25 mL浓盐酸(质量分数为 36% ~ 38%) ,加水定容至 500 mL。
B.1 .3 1 mol/L NaOH 溶液
称取 40 .0 g NaOH 溶于 800 mL水中 ,充分搅拌溶解 ,加水定容至 1 000 mL。
B.1 .4 1 mol/L TrisG HCl溶液
称取 121 .1 gTris碱溶于 800 mL水中 ,充分搅拌溶解 ,加 HCl调 pH 至 8 .0 ,加水定容至 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌 20 min。
B.1 .5 CTAB提取液
称取 20 .0 g CTAB、81 .7 g NaCl置于 1 000 mL 烧杯中 , 量取 100 mL 1 mol/L Tris_HCl溶液和40 mL 0 .5 mol/LEDTA溶液倒入烧杯中 ,加 700 mL水 ,充分搅拌溶解 ,加水定容至 1 000 mL,121 ℃高压灭菌 20 min。
B.1 .6 TE 缓冲液
量取 5 mL 1 mol/LTris_HCl溶液和 1 mL0 .5 mol/LEDTA溶液 ,加水定容至 500 mL,121 ℃高压灭菌 20 min,4 ℃保存。
B.2 PCR扩增试剂的配制
B.2 .1 dNTPs溶液
分别配制 dATP、dTTP、dCTP、dGTP终浓度为 100 mmol/L的储存液。 各取 20 μL混合 ,加 720 μL TE缓冲液定容 ,配制成每种脱氧核糖核苷酸终浓度为 2 .5 mmol/L 的工作液 , 121 ℃高压灭菌 20 min, - 20 ℃保存。
B.2 .2 SSR 引物溶液
开盖前瞬时离心 10 s,按照说明书加 TE缓冲液 ,分别配制正向引物和反向引物终浓度为 100 μmol/L
的储存液。 分别取 10 μL正向引物和反向引物储存液 ,加 180 μLTE缓冲液配制成终浓度 5 μmol/L的工
作液。
B.3 变性 PAGE试剂的配制
B.3 .1 质量分数为 40%的丙烯酰胺溶液
称取 190 .0 g 丙烯酰胺和 10 .0 g 甲叉双丙烯酰胺溶于 400 mL 水中 , 充分搅拌溶解 , 加水定容至500 mL,置于棕色瓶中 ,4 ℃储存。
B.3 .2 质量分数为 6%的变性 PAGE胶溶液
称取 420 .0 g尿素置于 1 000 mL烧杯中 ,加入 100 mL 10×TBE缓冲液和 150 mL质量分数为 40%
的丙烯酰胺溶液 ,定容至 1 000 mL。
B.3 .3 亲和硅烷缓冲液
分别量取 99 .5 mL无水乙醇和 500 μL冰醋酸 ,加水定容至 100 mL。
B.3 .4 亲和硅烷工作液
分别量取 1 mL亲和硅烷缓冲液和 5 μL亲和硅烷原液 ,混匀。
B.3 .5 剥离硅烷工作液
分别量取 25 mL二甲基二氯硅烷和 75 mL三氯甲烷 ,混匀。
B.3 .6 质量分数为 10%的 APS溶液
称取 1 .0 gAPS溶于 10 mL水中 ,混匀 ,于 4 ℃保存(不超过 5 d)。
B.3 .7 10× TBE 缓冲液
称取 Tris108 .0 g、硼酸 55 .0 g,溶于 800 mL水中 ,加入 37 mLEDTA溶液(0 .5 mol/L,pH 8 .0) ,定容至 1 000 mL。
B.3 .8 1×TBE缓冲液
量取 50 mL 10×TBE缓冲液 ,加水定容至 500 mL,混匀。
B.3 .9 6× 加样缓冲液
分别称取 0 .25 g 溴酚蓝和 0 .25 g 二甲苯青 , 加入 98 mL 去离子甲酰胺和 2 mL EDTA 溶液(0 .5 mol/L,pH 8 .0) ,搅拌溶解。
B.4 银染溶液的配制
B.4 .1 固定液
量取 100 mL冰醋酸 ,加水定容至 1 000 mL。
B.4 .2 染色液
称取 1 .0 g硝酸银 ,加水定容至 1 000 mL。
B.4 .3 显影液
称取 20 .0 g氢氧化钠溶于 1 000 mL水中 ,用前加 1 .5 mL 甲醛。
附录 C (规范性)引物及序列
引物及序列见表 C.1。
表 C.1 引物及序列
附录 D (资料性)
引物相关信息
引物相关信息见表 D.1。
表 D.1 引物相关信息
表 D.1 (续)
表 D.1 (续)
附录 E
(资料性)
参照品种相关信息
参照品种相关信息见表 E.1 .
表 E.1 参照品种相关信息
附录 F (资料性)引物分组
引物分组见表 F.1。
表 F.1 引物分组
