以下是《NY/T 4499-2025 不结球白菜品种鉴定SSR分子标记法》核心内容的系统总结：
一、标准基础信息
- 标准号 ：
- 名称 ：不结球白菜品种鉴定SSR分子标记法
- 发布日期 ：2025-01-09
- 实施日期 ：2025-05-01
- 归口单位 ：全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC 277）
- 起草单位 ：农业农村部科技发展中心、华南农业大学、上海市农业科学院、南京农业大学
二、适用范围
- 适用于不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）品种的DNA分子数据采集和品种鉴定。
三、技术原理
- 利用不结球白菜基因组中稳定遗传的 简单重复序列（SSR）标记 ，通过PCR扩增及电泳检测不同品种在同一SSR位点的重复次数差异（等位变异），实现品种区分。
四、核心流程与要求
1. 样品准备
- 样品类型 ：种子、幼苗、叶片等组织（种子需符合GB/T 3543.2扦样要求）。
- 样本量 ：每份样品不少于30个个体，等量混合分析；必要时进行个体检测。
2. DNA提取
- 推荐方法 ：CTAB法（详细步骤见标准10.2）：
- 研磨组织后加入CTAB提取液，65℃水浴45-60min。
- 三氯甲烷-异戊醇（24:1）抽提，异丙醇沉淀DNA。
- 乙醇洗涤后溶解于TE缓冲液或双蒸水，检测浓度（OD260/OD280宜为1.7-2.0）。
3. PCR扩增
- 反应体系 （总体积20μL）：
| 组分 | 终浓度 | 体积（μL） |
| 10×缓冲液（含Mg²⁺） | 1× | 2.0 |
| dNTPs | 0.2 mmol/L | 1.6 |
| Taq酶 | 0.05 U/μL | 0.2 |
| 引物（正向/反向） | 0.25 μmol/L | 各1.0 |
| DNA模板 | 2.5 ng/μL | 2.0 |
- 反应程序 ：
- 94℃预变性5min → 35循环（94℃ 30s → 55℃ 30s → 72℃ 45s）→ 72℃延伸10min → 4℃保存。
4. 电泳检测
- 两种方法可选 ：
- (1) 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） ：
- 制胶：6% PAGE胶（含尿素），亲和硅烷/剥离硅烷处理玻璃板。
- 样品变性：95℃ 5min后冰浴。
- 电泳条件：1800V恒压，时间按片段大小调整（100-250bp对应1.5-3.5h）。
- 银染显影：固定液→染色液（硝酸银）→显影液（NaOH+甲醛）→定影。
- (2) 荧光毛细管电泳 ：
- 引物分组：按附录F将23对引物分为5组（根据荧光标记与片段范围）。
- 多重检测：同组内不同荧光标记引物的PCR产物混合上样。
- 变性：95℃ 5min后冰浴，使用DNA分析仪检测。
5. 数据分析
- 等位变异确定 ：
- 通过参照品种（附录E）或分子量标准确定片段大小。
- 记录格式：纯合位点（X/X）、杂合位点（X/Y，小片段在前）、缺失（0/0）。
- 结果比对 ：
- 逐一比对送检样品与对照样品的每个SSR位点。
- 统计检测位点数和差异位点数。
五、结果判定规则
- 判定标准 ：
- 差异位点数 > 2 → 判定为 “不同” 。
- 差异位点数 ≤ 2 → 判定为 “疑同” 。
- 结果表述模板 ：
“送检样品与对照样品采用[检测方法]，检测位点数为[数量]，差异位点数为[数量]，判定为[不同/疑同]。”
六、关键附录内容
- 附录A ：仪器与试剂清单
- 仪器：PCR仪、电泳系统、离心机、核酸浓度测定仪等。
- 试剂：CTAB、dNTPs、SSR引物、荧光染料（6-FAM/ROX/TAMRA/HEX）等。
- 附录B ：溶液配制方法
- CTAB提取液、TE缓冲液、10×TBE、银染试剂等详细配方。
- 附录C ：23对SSR引物序列及染色体定位（核心标记）。
- 附录D ：引物详细信息
- 荧光标记推荐、等位变异范围（如BrcSSR22: 155-191bp）、参照品种示例。
- 附录E ：84个参照品种清单（如甬青805、叶家青001），标注来源单位。
- 附录F ：荧光毛细管电泳引物分组方案（5组，避免片段重叠）。
七、注意事项
- 引物使用 ：
- PAGE检测用普通引物，毛细管电泳需荧光标记引物（标记于正向引物5'端）。
- 可序贯检测，差异位点数达判定标准时即可停止。
- 参照品种 ：
- 用于校正等位变异大小，需与待测样品同步检测。
- 同一名称不同来源的品种可能存在等位变异差异。
- 数据可靠性 ：
- 缺失位点需记录为0/0，避免漏检导致误判。
- 毛细管电泳需用参照品种消除仪器系统误差。
总结 ：该标准系统规范了利用SSR分子标记鉴定不结球白菜品种的全流程，涵盖样品处理、DNA提取、PCR扩增、电泳检测、数据分析及结果判定，并提供了详尽的试剂、引物和参照品种支持数据，确保鉴定结果的准确性和可重复性。
