以下是《NY/T 4488-2025 油料中褪黑素含量的测定液相色谱串联质谱法》的详细内容总结：
一、适用范围
- 适用对象 ：芝麻、大豆、花生等植物源性油料产品。
- 检测指标 ：褪黑素（Melatonin，化学式 C₁₃N₂H₁₆O₂，CAS号 73-31-4）。
- 灵敏度 ：
- 检出限（LOD）：0.3 μg/kg
- 定量限（LOQ）：1.0 μg/kg
二、方法原理
- 提取 ：样品经甲醇提取，室温避光静置24小时，超声辅助萃取。
- 净化 ：提取液经C18固相萃取柱（SPE）净化，依次用甲醇、水活化，甲醇水溶液淋洗后洗脱。
- 检测 ：净化液氮吹浓缩，复溶后过0.22 μm滤膜，用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测，外标法定量。
三、试剂与材料
- 关键试剂 ：
- 甲醇（色谱级）、甲酸铵（色谱级）、甲酸（色谱级）、褪黑素标准品（纯度≥95%）。
- 溶液配制 ：
- 甲醇水溶液（1+19, 7+3, 8+2等体积比）。
- 甲酸铵-甲酸-甲醇溶液（5 mmol/L甲酸铵 + 0.1%甲酸）。
- 褪黑素标准溶液：储备液（1 mg/mL）、中间液（10 μg/mL）、工作曲线液（1–500 ng/mL，临用现配）。
- 耗材 ：
- C18固相萃取柱（1000 mg, 6 mL）、0.22 μm疏水PTFE滤膜。
四、仪器设备
- 核心设备 ：液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS，配ESI离子源）。
- 辅助设备 ：
- 天平（0.1 mg精度）、离心机（≥4200 r/min）、组织捣碎机。
- 涡旋振荡器、氮吹仪、超声波萃取仪、固相萃取装置。
五、样品制备
- 前处理 ：
- 样品捣碎成粉末（花生需先切片再捣碎）， 立即连续分析 避免降解。
- 称样 ：精确称取5 g样品至50 mL离心管。
六、分析步骤
(1) 提取
- 加20 mL甲醇，涡旋1 min，避光静置24 h。
- 振荡15 min，超声30 min，离心（4200 r/min, 5 min），取10 mL上清液氮吹至干。
- 用2 mL甲醇水（1+19）复溶，待净化。
(2) 净化
- SPE柱活化 ：10 mL甲醇 → 10 mL水（流速1 mL/min）。
- 上样与淋洗 ：加载复溶液，10 mL甲醇水（1+19）淋洗，弃淋洗液。
- 洗脱 ：5 mL甲醇水（8+2）洗脱，收集洗脱液。
- 浓缩 ：40℃氮吹近干，0.5 mL甲醇水（7+3）复溶，过膜待测。
(3) LC-MS/MS检测条件
| 参数 | 设置 |
| 色谱柱 | C18柱（100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm） |
| 流动相 | A相：5 mmol/L甲酸铵 + 0.1%甲酸的甲醇溶液
B相：0.1%甲酸水溶液 |
| 梯度程序 | 0 min: 10% A → 5 min: 80% A → 10 min: 80% A → 12 min: 10% A → 15 min: 10% A |
| 流速 | 0.20 mL/min |
| 柱温 | 30℃ |
| 进样量 | 3 μL |
| 离子源 | ESI⁺（正离子模式） |
| 监测离子对 | 定量：233/174（CE 20 eV）
定性：233/216（CE 18 eV） |
(4) 定性与定量
- 定性 ：保留时间偏差≤±2.5%，离子丰度比符合表3允许误差。
- 定量 ：外标法，标准曲线浓度1–500 ng/mL。
七、结果计算
w = \frac{c \times V_2 \times V_1}{m \times V_3}
w：褪黑素含量（μg/kg）；c：样液浓度（ng/mL）；V_1：提取液体积（20 mL）；V_2：定容体积（0.5 mL）；V_3：净化用提取液体积（10 mL）；m：样品质量（5 g）。
结果要求 ：平行测定两次，取算术平均值（保留两位有效数字）。
八、精密度要求
- 重复性 ：两次独立结果绝对差值≤15%（算术平均值）。
- 再现性 ：两次独立结果绝对差值≤20%（算术平均值）。
九、附录
- 附录A ：褪黑素选择离子监测色谱图（示例见图A.1）。
标准归口与实施
- 提出单位 ：农业农村部种植业管理司。
- 归口单位 ：农业农村部。
- 实施日期 ：2025年5月1日。
此标准为植物源性油料中褪黑素检测提供了完整的LC-MS/MS方法，涵盖前处理、仪器参数、结果计算及质量控制要求，适用于质检、科研及生产监控领域。
