以下是NY/T 4485-2025《胡麻（油用亚麻）品种真实性鉴定SSR分子标记法》的主要内容总结：
一、标准核心目标
- 适用对象 ：油用亚麻（Linum usitatissimum L.）品种。
- 应用场景 ：
- 真实性验证 ：检验样品标注品种名称是否与标准样品一致。
- 身份鉴定 ：通过SSR指纹数据库比对确定样品的真实品种名称。
二、技术原理
利用不同胡麻品种基因组中 简单重复序列（SSR）重复次数的遗传差异 ，通过PCR扩增和电泳分离，根据扩增片段大小差异区分品种。
三、关键术语与定义
- 标准样品 ：代表品种特征的国家指定实物或DNA样品。
- SSR指纹数据比对平台 ：基于SSR标记构建的审定品种数据库，用于筛查品种身份。
- 参照样品 ：校准扩增片段大小的标准样品（附录D提供示例）。
- 组合引物（Panel） ：可混合电泳的荧光标记引物组。
四、检测方案
1. 引物选择
- 固定引物组 ：23对SSR引物（表1），编号FM01-FM23，包含序列、来源及荧光标记建议（附录B）。
- 验证 ：允许序贯检测（发现差异即终止）或全引物检测。
- 身份鉴定 ：必须使用全部23对引物。
2. 检测平台
- 选项 ：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或毛细管电泳。
- 高通量建议 ：组合使用自动研磨仪、DNA提取工作站、多引物毛细管电泳。
3. 样品要求
- 种子 ：≥4g或≥500粒。
- 组织器官 （幼苗/叶片）：≥30个个体，可混合或单个体检测。
4. 检测条件
- 人员需具备分子检测技能。
- 仪器需定期校准维护。
- 试剂耗材需灭菌处理。
五、检测程序
1. DNA提取
- 方法 ：改良CTAB法（详细步骤）或商业试剂盒法。
- 质量要求 ：OD260/OD280=1.7-2.0，浓度50-100 ng/μL。
2. PCR扩增
- 反应体系 （表2）：20μL体系，含缓冲液、dNTPs、Taq酶、引物、模板DNA。
- 程序 ：预变性→降落PCR（12循环）→恒定扩增（24循环）→终延伸。
3. 扩增产物分离
- PAGE电泳 ：
- 制胶：6%变性聚丙烯酰胺凝胶。
- 银染：固定→染色→显影→定影。
- 毛细管电泳 ：
- 混合扩增产物，甲酰胺变性。
- 基因分析仪检测，内标校准片段大小。
4. 数据分析
- 峰/带甄别规则 ：
- 剔除连带峰、(n+1)峰视为单峰。
- 连续多峰取最右侧峰（峰高叠加）。
- 仅采集前两位特异峰。
- 数据读取 ：
- 纯合位点：X/X；杂合位点：X/Y（小片段在前）。
- 缺失位点：0/0。
- 比对方式 ：
- 与标准样品直接比对。
- 上传SSR指纹数据库筛查（毛细管电泳优先）。
六、鉴定意见
依据差异位点数判定：
| 差异位点数 | 鉴定意见 |
| ≥3 | 排除为同一品种 |
| 1-2 | 不确定（需田间验证） |
| 0 | 不排除为同一品种 |
七、结果报告
- 真实性验证 ：注明差异位点数及引物编号。
- 身份鉴定 ：
- 匹配数据库品种：报告一致结论。
- 未匹配：注明“无法鉴定身份”。
- 特殊情况 ：需标注样品量不足、异质性严重位点等。
八、附录内容
- 附录A ：规范性溶液配制方法（CTAB提取液、电泳缓冲液、银染液等）。
- 附录B ：引物荧光标记分组方案（四色荧光组合）。
- 附录C ：23对引物的等位基因片段范围及参照品种（如FM01片段171-182bp）。
- 附录D ：参照样品（陇亚8号、伊亚4号）的等位变异数据。
九、关键创新点
- 建立 23对SSR引物标准体系 ，覆盖胡麻主要遗传位点。
- 提出 双模式鉴定流程 （验证 vs 身份鉴定）。
- 规范 高通量检测平台 组合方案。
- 制定 严格的数据甄别规则 ，减少假阳性/阴性。
十、实施要求
- 检测需在 标准化实验室 进行，符合GB/T 6682用水标准。
- 结果存疑时，按GB/T 3543.5进行 田间种植验证 。
此标准为胡麻品种真实性鉴定提供了分子级别的标准化方案，兼顾准确性、效率及可操作性。
