ICS 07.080
CCS A 40
团体标准
T/ SDHCST001—2024
产前荧光原位杂交实验操作技术规范
Technical Specification for Prenatal Fluorescence in situ hybridization
2024年6月12日发布2024年7月10日实施
山东省保健科技协会
目录
前言.............................................................................................................................................. 2
1 范围.............................................................................................................................................. 1
2 规范性引用文件............................................................................................................................ 1
3 术语和定义................................................................................................................................... 1
4 符号和缩略语............................................................................................................................... 2
5 检测时间与用量............................................................................................................................ 2
6 荧光原位杂交产前诊断对象......................................................................................................... 2
7 羊膜穿刺术前准备........................................................................................................................ 3
8 样本采集与处理............................................................................................................................ 3
9 仪器与试剂准备............................................................................................................................ 4
10 操作步骤..................................................................................................................................... 5
11 室内质量控制标准...................................................................................................................... 9
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Ⅱ
前言
本标准依照GB 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化标准的结构和起草规则》的规定起草。本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省保健科技协会提出并归口。
本标准起草单位：山东省药物研究院、淄博市妇幼保健院、山东卫康医学检验有限公司。
本标准主要起草人：李胜、牟凯、吴慧、吕国健、刘轶、孙学成、刘娜、郑茂坤、王梦晗、刘智鸿、王文君、高德海、夏梅、黄正、黄璐璐、谢春波、孟祥吉、刘晓峰、孙丹丹、车美玲本标准为首次发布。
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产前荧光原位杂交实验操作技术规范
1 范围
本标准规定了产前荧光原位杂交技术(FISH)的检测时间、检测疾病、检测对象、检测流程、检测报告、资料和标本的管理和质量控制。
本检测适用于符合某些产前诊断指征中针对13、18、21、X、Y号染色体数目异常孕妇进行染色体非整倍性的快速辅助诊断。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
GB 19489 实验室生物安全通用要求；
GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法；
《荧光原位杂交技术在产前诊断中的专家共识》；
《医疗废物管理条例》。
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文本。
3.1 羊膜穿刺术（Amniocentesis）
羊水是指充满于羊膜腔内的液体。羊水的来源、量和成分随孕周不同而有所变化。妊娠初期，羊水主要是母体血清通过胎盘进入羊膜腔的透析液，少量从胎盘表面和脐带表面渗出。做产前诊断最佳穿刺抽取羊水时间是妊娠16～24周。因为此时胎儿较小，羊水相对较多，胎儿漂在羊水中，周围有较宽的羊水带，行
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羊膜穿刺时，不易刺伤胎儿。
3.2 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）
利用碱基互补配对的原理，以荧光素标记已知序列的核苷酸片段作为探针，通过核酸杂交，直接在组织切片、细胞涂片、染色体制备标准上杂交，通过检测荧光来定性和定位目的核酸片段。FISH具有安全快速、敏感高效、探针可长期保存、能同时显示多种颜色等优点。
4 符号和缩略语
FISH：荧光原位杂交；
DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚；
PBS：磷酸缓冲盐溶液
5 检测时间与用量
产前荧光原位杂交技术检测的时间为孕16-24周，羊水用量8-10mL。羊水的体积随着孕周的增加而增加，孕16周时为180-200mL，孕20周时约为400mL，此时子宫已超出盆腔，羊水中活细胞比例比较高，抽取30mL左右的羊水也较为安全，是中孕期羊膜腔穿刺的最佳时机。
6 荧光原位杂交产前诊断对象
6.1羊膜穿刺术指征
（1）预产期年龄≥35岁；
（2）产前筛查（血清学筛查或NIPT）高风险者；
（3）夫妇一方为染色体异常或遗传性疾病携带者；
（4）曾生育过染色体异常或单基因病的患儿；
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（5）超声发现胎儿结构异常；
（6）其他需要抽取羊水检查的情况。
6.2羊膜穿刺术禁忌症
（1）先兆流产；
（2）术前两次测量体温（腋温）高于37.2℃；
（3）有出血倾向（血小板≦70×109/L）；
（4）有盆腔或宫腔感染征象；
（5）无医疗指征的胎儿性别鉴定等。
7 羊膜穿刺术前准备
7.1 术前告知签署知情同意书
（1）认真核对适应症及有无禁忌症；
（2）向孕妇说明羊膜穿刺术可能发生的并发症及检查的意义和局限性，签署知情同意书。
7.2完善相关术前检查
（1）血分析、尿分析、凝血四项、传染病八项、ABO血型、Rh血型等；
（2）B超检查了解情况以及胎盘附着情况。
8 样本采集与处理
8.1标本的采集
门诊标本由拥有产前诊断资格的医师采集，抽出的羊水注入无菌离心管内（本操作在酒精灯火焰附近进行），然后室温下送至实验室。采集符合羊膜穿刺管理规范。具体骤如下：具有适应症的孕妇先做B超，确定胎盘位置、胎儿情况，
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T/ SDHCST001—2024避免误伤胎盘。由产前诊断医师协商选好进针位置后，消毒皮肤，铺消毒巾，用带针心的腰穿针在选好的点处垂直刺入；针穿过腹壁和子宫壁时有两次落空感，取出针心；用 5mL 注射器抽吸羊水 2mL 弃去，此段羊水可能含母体细胞；再用20mL 空针抽吸羊水 20mL，分别装在 2 支消毒试管内，加盖；取出针头，盖消毒纱布，压迫 2-3min，孕妇卧床休息 2h。 8.2 标本的接收 （1）所有标本均可能具有传染性，须严格遵守《医疗废物管理条例》中华人民共和国国务院令第 380 号的规定，工作人员须注意保持并随时检查容器的完整和无标本外泄发生。（2） 接收标本时应核对标本与检验申请单的一致性。工作人员有权拒收与检验申请单不一致的标本、标识不清的标本。检验申请有不清晰情况时，应及时与临床科室或相关人员联系核实。
（3）标本接收人须检查标本状态。
（4）标本合乎要求，须在可接收标本记录本上按内容记录，作进一步处理，标本不合乎要求，须在记录本上记录拒收原因
8.3标本的保存
（1）处理前的标本保存
新鲜羊水离心储存置 4℃过夜备用。
（2）报告发出后的标本保存：
a）经固定后的羊水细胞标本置1.5mL离心管内可室温长期保存；
b）载玻片可于-20℃下避光保存1个月。
9 仪器与试剂准备
9.1仪器
移液器（sartorius）、数显恒温三用水浴箱（江苏金域国胜实验仪器厂）、
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T/ SDHCST001—2024通风柜（山东-豪迈）、离心机（江苏金域国胜实验仪器厂）、电热恒温培养箱（江苏金城国胜实验仪器厂 DHP-500）、荧光倒置显微镜（OLYMPUS BX53）。9.2 试剂甲醇（国药，AR 级）、冰醋酸（国药，AR 级）、75%及无水乙醇（国药）、纯水、生理盐水、产前染色体数目检测试剂盒（安必平）。
产前染色体数目检测试剂盒检测位点如下：
可检测疾病
目标染色体
检测区域
T21（唐氏综合征）
21 号染色体
21q22.13
T18（爱德华氏综合征）
18 号染色体
18p11.1-q11.1
T13（帕陶氏综合征）
13 号染色体
13q14.2
性染色体数目异常疾病
X染色体
Xp11.1-q11.1
Y染色体
Yp11.1-q11.1
10 操作步骤
10.1制片
10.1.1低渗
离心（1800r、10分钟）去上清，加入6 mL提前预热至37℃的KCl低渗液，轻轻吹打细胞，37℃水浴32 min，每8 min吹打1次，共4次。
10.1.2固定
固定液需新鲜配制，固定液比例为甲醇：乙酸=3:1。
（1）预固定：直接于细胞低渗液中缓慢加入2 mL固定液，吹打混匀，静置1min。
（2）固定：离心，去上清，加入6 mL固定液，吹打混匀，室温静置10 min（此步骤重复2次）。
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10.1.3滴片
（1）滴片前准备：载玻片对应标记FISH编号与患者姓名、1.5 mL离心管标记FISH编号。
（2）滴片：离心去上清，将20 μL悬液滴至干净的、水平放置的载玻片的中央位置，自然摊片。然后，将剩余悬液置于1.5 mL离心管中密封保存。
10.1.4老化玻片
将滴片后的载玻片至于56 ℃烤箱中烤片0.5～1h。
10.2预处理
注意：胃蛋白酶溶液配制：40mL纯水+400 μL的1M的HCL置于37℃水浴中，使用前加入100 μL的10%的胃蛋白酶。
（1）将干燥的样品放入37 ℃的1*PBS中孵育5 min。
（2）取出玻片，放入37 ℃预热的胃蛋白酶溶液中消化10 min。
（3）取出玻片，放入1*PBS室温洗涤3 min。
（4）取出玻片，放入1%多聚甲醛/ PBS室温固定10 min。
（5）取出玻片，放入1*PBS室温洗涤3 min。
（6）取出玻片，将其依次放入70%、90%、100%的梯度乙醇中脱水，各2 min。
（7）取出玻片，室温晾干。
10.3变性&封片
（1）提前从2-8℃冰箱中取出杂交液，37℃环境下预热10 min后，震荡均匀。
（2）室温下将10 μL的13/21杂交液、18/XY杂交液分别对应滴加至玻片杂交区域，立刻加盖盖玻片，然后用橡皮胶封片。
（3）然后置于82 ℃水浴箱中变性5 min。
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10.4杂交
将封片后的载玻片置于37 ℃条件下、避光杂交过夜处理（或者在45℃条件下杂交2-4h）。
10.5杂交后洗涤
（1）次日将洗液I置于72℃水浴锅中提前预热。
（2）将杂交后的载玻片取出，轻轻撕去橡皮胶，移去盖玻片（若盖玻片难以去除，可将其放入室温洗液II中微微润湿，以利于其脱落，取下盖玻片后应立即将样本片放入72℃的洗涤液I中）。
（3）将载玻片放入72℃的洗液I中5 min。
（4）取出载玻片，放入室温洗液II中洗涤2 min。
（5）取出载玻片，将其依次放入70%、90%、100%的梯度乙醇脱水各2 min。
（6）取出载玻片，室温晾干。
10.6复染
室温滴加10μL DAPI复染剂II，立即盖上盖玻片，避免气泡产生，复??-10min后即可观察。
10.7镜检
相关荧光需用合适的滤块观察；其中，13/21杂交液区染色体探针分别显示为绿色（G）/红色（R）信号；18/X/Y杂交液区染色体探探针分别显示为青色（A）/绿色（G）/红色（R）信号针分别显示为绿色。
（1）使用合适的滤镜，现在10X物镜下寻找细胞核，在100X物镜下寻找目标信号并计数；
（2）对信号和背景有明确的概念；信号点应位于细胞核内；当细胞核外存在荧光信号点时，要注意与细胞核内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；按照从左上到右下的折线方式连续观察；只计数每种颜色荧光信号点≥1的细胞核；注意跳过信号弱及没有特定信号或高背景的核计数；
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10.8结果判读:
双人独立阅片，高级职称检验者审核，每个标本随机计数50个细胞核：
（1）13/21号染色体判读：绿色（G）/红色（R）显示2个荧光信号时为正常；若绿色（G）/红色（R）显示3个荧光信号时则为13/21号三体型。
（2）18/X/Y染色体判读：
18号染色体判读：青色（A）显示2个荧光信号时为正常，显示3个荧光信号时则为18染色体三体型。
性染色体判读：
女性：绿色（G）显示2个荧光信号时为正常（46,XX）；若绿色（G）显示3个荧光信号时则为X染色体三体型（47,XXX）；若绿色（G）显示1个荧光信号时则为X染色体单体型（45,X）。
男性：绿色（G）/红色（R）各显示1个荧光信号时为正常（46,XY）；若绿色（G）显示2个荧光信号,红色（R）显示1个荧光信号时为克氏综合征（47,XXY）；若绿色（G）显示1个荧光信号,红色（R）显示2个荧光信号时为超雄综合征（47,XYY）.
（3）单独判断每种指正：正常细胞比例≥90%，异常细胞的比例≤10%，提示该指标未见异常。
（4）当出现嵌合体（10%-60%）情况时：样本计数需要计数分析100个细胞核，当样本中可被有效分析的细胞核少于50个时，应增加一张样本片继续计数分析，或判断为样本信息不足。
10.9实验记录
（1）每次实验按照流程填写好《羊水FISH实验质控记录单》；
（2）每人1份《羊水FISH样本计数单》，做好样本数据记录。
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11 室内质量控制标准
（1）注意离心力的大小，过大会导致细胞核破裂，导致标本作废。
（2）洗脱步骤很关键，增加洗脱时间，升高温度或降低盐溶液浓度可导致信号减弱甚至消失，反之可导致背景信号增强，整个杂交和杂交后检测过程要始终保持标本的湿润，以防载波片干燥后引起非特异性染色。
（3）使用对光线敏感的试剂，如PI或DAPI时，应避免在亮光下操作，同时也是一种潜在致癌物，使用时注意避免直接皮肤接触。
（4）盖玻片下气泡影响探针杂交，一旦发现，应想办法将之去除。
（5）探针和做过FISH的玻片都要避光于-20℃冰箱中保存。
（6）需由两名具有相应资质的专业技术人员计数，两人计数结果误差率应控制在10%以内，如果大于10%，则需要另外一位专业技术人员再进行计数，必要时重新做一次FISH以保证结果准确可靠。
（7）计数的细胞必须是完整的，与其他细胞没有相互重叠。细胞中需要有清晰可辨的信号，且在细胞内。避免计数信号在细胞边缘的细胞及异常明亮或者背景很强的细胞，以避免影响结果判读。
（8）其对于一个标本要做好结果记录并至少采集存储图片两张，记录单上要有受检者名字、性别、年龄、编号、标本来源、收受日期、出具报告日期和检测者名字等。
