ICS 03.080.99
CCS X 00
团体标准
T/SATA 077—2024
血清中20 种类固醇激素的测定高效液相色谱-串联质谱法
Determination of 20 steroid hormones in serum——High performance liquidchromatography tandem mass spectrometry
2024-09-25 发布2024-10-25 实施
深圳市分析测试协会发布
目次
前言.................................................................................. II
1 范围................................................................................ 1
2 规范性引用文件...................................................................... 1
3 术语和定义.......................................................................... 1
4 原理................................................................................ 2
5 试剂与材料.......................................................................... 2
6 仪器和设备.......................................................................... 2
7 分析步骤............................................................................ 3
8 结果计算............................................................................ 4
9 灵敏度、精密度...................................................................... 4
附录A（资料性） 20 种类固醇激素标准品信息、保留时间及内标物........................... 5
附录B（资料性） 20 种类固醇激素及内标物定量定性离子对及去簇电压、碰撞能量............. 6
附录C（资料性） 20 种类固醇激素及11 种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图............... 8
附录D（资料性） 20 种类固醇激素的检出限、定量限...................................... 10
参考文献.............................................................................. 11
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II
前言
本文件按照GB 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件由深圳市计量质量检测研究院提出。
本文件由深圳市分析测试协会归口。
本文件起草单位：深圳市计量质量检测研究院、深圳市宝安区公共卫生服务中心、深圳深检集团医
学检验实验室、深圳市农产品质量安全检验检测中心、深圳市龙岗中心医院、四川大学、南方科技大学
医院、深圳市人民医院、广州中医药大学深圳医院（福田）、深圳市龙岗妇幼保健院、深圳恒生医院。
本文件主要起草人：李子樱、陈欣、刘爱平、谷素英、肖伟敏、孙亮、杨国武、孙丽萍、刘成文、
曾懿、王力弘、赵云霞、张玉鑫、陈佳平、王奇、罗敏、于建渤、李博、李小峰、李永新、袁小澎、赵
洪悦、纪昕、于波海、周珍文、张光辉。
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1
血清中20 种类固醇激素的测定
高效液相色谱-串联质谱法
1 范围
本文件规定了血清中20种类固醇激素（褪黑素、脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、双氢睾酮、孕烯醇
酮、孕酮、17α-羟孕酮、21α-羟基孕酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质酮、可的松、氢化可
的松、雌酮、雌二醇、雌三醇、17α-羟基孕烯醇酮、醛固酮、硫酸脱氢表雄酮）的液相色谱-串联质谱
测定方法。
本文件适用于血清中20种类固醇激素的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 32465-2015 化学分析方法验证确认和内部质量控制要求
WS/T 478-2024 血清25-羟基维生素D2和D3的检测同位素稀释液相色谱串联质谱法
WS/T 225-2024 临床化学检验血液标本的采集与处理
WS/T 661 静脉血液标本采集指南
WS/T 408-2024 定量检验程序分析性能验证指南
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
内标internal standard
在定量分析时，加入到样品中作为参比物的已知量的化合物纯品。
3.2
检出限limit of detection
检测方法在规定的实验条件下所能检出分析物的最低浓度。
3.3
定量限limit of quantification
在满足实验室对准确性和精密度要求的前提下，检测方法在规定的实验条件下所能准确定量检测分
析物的最低可测量浓度或量。
3.4
线性linearity
在给定的测量范围内，使测定结果与样品中分析物的量直接成比例的能力。此处的测定结果指最终
的分析结果，而非仪器输岀的原始信号。
3.5
线性范围linear range
使实验系统的最终分析结果为可接受的线性的浓度范围，此时非线性误差应低于允许误差。
3.6
基质效应matrix effect
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2
标本中除分析物之外的样品性质对分析物测定结果的影响。
4 原理
试样以乙酸乙酯溶液作为萃取剂，通过液液萃取的原理将血清中的类固醇激素富集至萃取剂中，得
到血清中分离和纯化的类固醇激素，用高效液相色谱-串联质谱测定，通过建立的标准品标准曲线与各
自内标峰面积比计算血清中 20 种类固醇激素的浓度。
5 试剂与材料
除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB 6682 规定的一级水。
5.1 试剂
5.1.1 甲醇（CH4O）：质谱纯。
5.1.2 乙酸乙酯（C4H8O2）：质谱纯。
5.1.3 乙酸铵（CH3COONH4）：分析纯。
5.2 试剂配制
5.2.1 0.1 mol/L 乙酸铵溶液：准确称取 1.000 g 乙酸铵，加入 130 mL 水溶解备用。
5.2.2 1 mmol/L 乙酸铵溶液：准确移取 0.1 mol/L 乙酸铵溶液（5.2.1）1 mL，至 100 mL 容量瓶，用水
定容至刻度备用。
5.2.3 1 mmol/L 乙酸铵-甲醇溶液：用 1 mmol/L 乙酸铵溶液（5.2.2）和甲醇（5.1.1）按 6：4 体积比
混合备用。
5.3 标准品
类固醇标准物质及稳定同位素内标物，纯度大于或等于 95% 或有证标准物质，20 种类固醇激素中
文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量等详见附录A。
5.4 标准溶液配制
5.4.1 外标标准储备液（500 μg/mL）：分别准确称取 50.0 mg（精确至 0.0001 g）各标准品，用甲醇
溶解并转移至 100 mL 容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为 500 μg/mL 标准储备液，于 -20 ℃ 避光保
存，可稳定 6 个月。
5.4.2 外标混合标准中间液（10.0 μg/mL)：准确移取 500 μL 各类固醇激素标准储备液（5.4.1）于
25 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。于 -20 ℃ 避光保存，可稳定 3 个月。
5.4.3 内标混合标准储备液（5.00 μg/mL)：分别移取 500 μL 各内标单标标准溶液（100 μg/mL）至
10 mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度（若购买的内标为固体标准品，则需先配制成浓度为 100 μg/mL 的内
标单标溶液）。于 -20 ℃ 避光保存，可稳定 2 个月。
5.4.4 外标混合标准工作液（1.00 μg/mL）：准确移取 500 μL 外标混合标准中间液（5.4.2）至 5 mL
容量瓶中，用 1 mmol/L 乙酸铵-甲醇溶液（5.2.3）定容至刻度。临用前配制。
5.4.5 内标混合标准工作液（200 ng/mL）：准确移取 200 μL 内标混合标准储备液（5.4.3）至 5 mL
容量瓶中，用 1 mmol/L 乙酸铵-甲醇溶液（5.2.3）定容至刻度。临用前配制。
6 仪器和设备
6.1 液相色谱-串联质谱仪：配置电喷雾电离源。
6.2 分析天平：感量 0.000l g。
6.3 涡旋混合器。
6.4 离心机：转速不低于 10000 r/min。
6.5 冷冻抽干机。
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3
7 分析步骤
7.1 样品前处理
准确移取 100 μL 血清样本，加入 10.0 μL 200 ng/mL 内标混合标准工作液（5.4.5），加入 1.2 mL
乙酸乙酯溶液（5.1.2），涡旋提取（2500 rpm，10 min），冰上孵育 10 min，离心（18000 rpm，4 ℃，
10 min），取上清液进行冷冻抽干，用 100 μL 1 mmol/L 乙酸铵水溶液-甲醇溶液（v/v=6：4）复溶，离
心（18000 rpm，4 ℃，10 min），取上清液于样品瓶中，用于LC-MS/MS检测分析。
7.2 仪器参考条件
7.2.1 液相条件
a) 色谱柱：C18 液相色谱柱（2.7 μm 2.1 × 100 mm），或相当者；
b) 流动相：1 mmol/L 乙酸铵水溶液（流动相A）和甲醇溶液（流动相B）；
c) 流速：0.3 mL/min；
d) 柱温：40 ℃ ± 0.5 ℃；
e) 进样量：5 μL；
f) 洗脱梯度见表1。
表1 超高效液相色谱洗脱梯度参考条件
梯度时间/min 流动相A/% 流动相B/%
0.0 60.0 40.0
0.5 60.0 40.0
2.5 50.0 50.0
8.0 55.0 45.0
8.5 55.0 45.0
10.5 25.0 75.0
11.0 5.0 95.0
13.5 5.0 95.0
14.0 60.0 40.0
15.5 60.0 40.0
7.2.2 质谱条件
a) 离子源：电喷雾离子源(ESI)；
b) 检测方式：多反应监测(MRM)；
c) 扫描方式：正离子模式、负离子模式；
d) 电喷雾电压：1.75 kV(+)/ 3.00 kV(-)；
e) 离子源温度：600 ℃；
f) 雾化气：7.0 Bar；
g) 去溶剂气流量：1000 L/hr；
h) 锥孔反吹气流量：150 L/hr；
i) 监测离子对和定量离子对等信息详见附录B；20 种类固醇激素及 11 种内标物的多反应监测
（MRM）质量色谱图详见附录C。
注：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。
7.3 标准曲线的制作
用 1 mmol/L 乙酸铵水溶液-甲醇溶液（5.2.3）、1.0 μg/mL 外标混合标准工作液（5.4.4）、200 ng/mL
内标混合标准工作液（5.4.5）配制混合标准溶液工作曲线：0.01 ng/mL、0.02 ng/mL、0.05 ng/mL、
0.10 ng/mL、0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、
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50.0 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL。标准系列工作溶液中各内标的浓度为 20 ng/mL。不同
物质根据实际情况采用不同范围的标准曲线。
将标准系列工作液由低浓度到高浓度依次进样，以待测类固醇激素与对应同位素内标的峰面积比值
为纵坐标，以标准系列工作液浓度（ng/mL）为横坐标，分别绘制20种类固醇激素的标准曲线。
7.4 定性和定量
7.4.1 保留时间
被测试样中目标色谱峰与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在± 2.5% 之内。
7.4.2 离子丰度比
按照高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中各化合物的色
谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的试样与标准
工作溶液中相应成分的相对离子丰度，定性时离子丰度比的最大允许偏差见表 2。
表2 定性时离子丰度比的最大允许偏差
相对丰度（%） 最大允许偏差（%）
K ＞ 50% ± 20
50% ≥ K > 20% ± 25
20% ≥ K > 10% ± 30
K ≤ 10% ± 50
7.4.3 试样溶液的测定
将处理完毕的试样（7.1）按仪器参考条件（7.2）进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积。
根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。
8 结果计算
将液相色谱-质谱测得浓度代入下式计算含量：
� = ��1
�2
�························································ (1)
式中：
� ——试样中各待测物的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
� ——从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
�1——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
�2——取样体积，单位为毫升（mL）；
� ——稀释倍数。
结果保留三位有效数字。
9 灵敏度、精密度
9.1 灵敏度
各类固醇激素的检出限及定量限见附录 D。
9.2 精密度
依据已发布的行业标准等规范性文件，对方法的精密度进行验证，定量检测下限浓度附近低值 CV
＜20％,其余浓度 CV＜15％。
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A
A
附录A
（资料性）
20 种类固醇激素标准品信息、保留时间及内标物
20种类固醇激素标准品信息及内标物见表A.1。
表A.1 20 种类固醇激素标准品信息、保留时间及内标物
序号中文名称英文名称CAS号分子式分子量
1 褪黑素Melatonin 73-31-4 C13H16N2O2 232.27
2 雌三醇Estriol 50-27-1 C18H24O3 288.38
3 醛固酮Aldosterone 52-39-1 C21H28O5 360.44
4 可的松Cortisone 53-06-5 C21H28O5 360.44
5 硫酸脱氢表雄酮Dehydroepiandrosterone sulfate 651-48-9 C19H28O5S 368.49
6 氢化可的松Cortisol/Hydrocortisone 50-23-7 C21H30O5 362.46
7 21-脱氧皮质醇21-Doxycortisol 641-77-0 C21H30O4 346.46
8 皮质酮Corticosterone 50-22-6 C21H30O4 346.46
9 11-脱氧皮质醇11-Doxycortisol 152-58-9 C21H30O4 346.46
10 雄烯二酮Androstenedione 53-06-5 C19H26O2 286.41
11 17α-羟孕酮17α-Hydroxyprogesterone 604-09-1 C21H30O3 330.46
12 雌酮Estrone 53-16-7 C18H22O2 270.37
13 雌二醇Estradiol 50-28-2 C18H24O2 272.38
14 脱氢表雄酮Dehydroepiandrosterone 53-43-0 C19H28O2 288.42
15 21α-羟基孕酮21-Hydroxyprogesterone 64-85-7 C21H30O3 330.46
16 睾酮Testosterone 58-22-0 C19H28O2 288.42
17 17α-羟基孕烯醇酮17α-hydroxypregnenolone 387-79-1 C21H32O3 332.48
18 双氢睾酮Stanolone 521-18-6 C19H30O2 290.44
19 孕酮Progesterone 57-83-0 C21H30O2 314.46
20 孕烯醇酮Pregnenolone 145-13-1 C21H32O2 316.47
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B
B
附录B
（资料性）
20 种类固醇激素及内标物定量定性离子对及去簇电压、碰撞能量
20种类固醇激素及内标物定量定性离子对及去簇电压、碰撞能量见表B.1。
表B.1 20 种类固醇激素及内标物定量定性离子对及去簇电压、碰撞能量
序号化合物电离方式母离子(m/z) 子离子(m/z) 去簇电压（V） 碰撞能量(eV)
1 褪黑素ESI+ 233.1
174.1* 40 12
159.0 40 30
2 脱氢表雄酮ESI+ 271.2
213.2* 45 12
197.2 45 14
3 雄烯二酮ESI+ 287.2
109.0* 56 24
97.0 56 24
4 睾酮ESI+ 289.2
109.0* 38 21
97.0 38 22
5 双氢睾酮ESI+ 291.2
255.2* 45 14
159.1 45 16
6 孕烯醇酮ESI+ 299.3
159.1* 40 28
299.3 40 28
7 孕酮ESI+ 315.2
109.0* 98 22
97.0 98 20
8 17α-羟孕酮ESI+ 331.2
109.0* 32 23
97.0 32 24
9 21α-羟基孕酮ESI+ 331.2
109.0* 35 22
97.0 35 23
10 11-脱氧皮质醇ESI+ 347.2
97.0* 45 24
121.0 45 24
11 21-脱氧皮质醇ESI+ 347.2
175.1* 45 30
311.2 45 30
12 皮质酮ESI+ 347.2
329.3* 35 15
311.2 35 15
13 可的松ESI+ 361.2
163.1* 40 25
121.0 30 27
14 氢化可的松ESI+ 363.2
327.2* 30 15
121.0 30 27
15 雌酮ESI- 268.8
145.1* 40 38
182.6 40 34
16 雌二醇ESI- 270.9
145.1* 40 40
182.7 40 40
17 雌三醇ESI- 287.2
170.8* 40 36
144.9 40 40
18 17α-羟基孕烯醇酮ESI- 330.9
287.2* 30 26
313.2 30 21
19 醛固酮ESI- 359.1
189.0* 20 18
297.2 20 12
20 硫酸脱氢表雄酮ESI- 367.2
97.0* 45 30
79.9 45 30
21 褪黑素-D4 ESI+ 236.8
219.9* 30 18
177.8 30 18
22 雄烯二酮-13C3 ESI+ 290.0
112.0* 38 25
100.0 38 25
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序号化合物电离方式母离子(m/z) 子离子(m/z) 去簇电压（V） 碰撞能量(eV)
23 睾酮-13C3 ESI+ 292.0
112.0* 38 21
100.0 38 21
24 脱氢表雄酮-D6 ESI+ 295.2
219.0* 35 19
259.2 35 13
25 孕烯醇酮-D4 ESI+ 321.2
285.2* 35 15
159.0 35 25
26 孕酮-D9 ESI+ 325.3
100.0* 35 17
113.1 35 23
27 皮质酮-D4 ESI+ 350.9
120.9* 30 21
332.9 30 14
28 氢化可的松-D4 ESI+ 366.9
330.9* 30 15
120.8 30 20
29 雌酮-D4 ESI- 273.2
187.1* 30 35
160.8 30 35
30 雌二醇-D5 ESI- 276.0
146.7* 30 40
186.8 30 42
31 雌三醇-D3 ESI- 289.9
172.7* 30 35
147.0 30 38
注：带*为定量离子。
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C
C
附录C
（资料性）
20 种类固醇激素及11 种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图
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图C.1 20 种类固醇激素及11 种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图
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D
D
附录D
（资料性）
20 种类固醇激素的检出限、定量限
20种类固醇激素的检出限、定量限见表D.1。
表D.1 20 种类固醇激素的检出限、定量限
序号化合物英文名称
浓度（ng/mL）
检出限定量限
1 褪黑素Melatonin 0.0005 0.002
2 脱氢表雄酮Dehydroepiandrosterone 0.5 2
3 雄烯二酮Androstenedione 0.005 0.02
4 睾酮Testosterone 0.005 0.02
5 双氢睾酮Stanolone 0.05 0.2
6 孕烯醇酮Pregnenolone 0.2 1.0
7 孕酮Progesterone 0.1 0.5
8 17α-羟孕酮17α-Hydroxyprogesterone 0.01 0.05
9 21α-羟基孕酮21-Hydroxyprogesterone 0.005 0.02
10 11-脱氧皮质醇11-Doxycortisol 0.002 0.01
11 21-脱氧皮质醇21-Doxycortisol 0.2 1.0
12 皮质酮Corticosterone 0.05 0.2
13 可的松Cortisone 0.01 0.05
14 氢化可的松Cortisol/Hydrocortisone 0.01 0.05
15 雌酮Estrone 0.002 0.01
16 雌二醇Estradiol 0.1 0.5
17 雌三醇Estriol 0.01 0.05
18 17α-羟基孕烯醇酮17α-hydroxypregnenolone 0.5 2
19 醛固酮Aldosterone 0.005 0.01
20 硫酸脱氢表雄酮Dehydroepiandrosterone sulfate 0.002 0.01
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参考文献
[1]Karashima S, Osaka I. Rapidity and precision of steroid hormone measurement[J]. Journal
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[2]Taylor D R, Ghataore L, Couchman L, et al. A 13-steroid serum panel based on LC-MS/MS:
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[3]Jia Y, Liu X, Xu L, et al. Liquid chromatography–tandem mass spectrometry measurement
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2021, 44(12): 2358-2370.
[4]Luque-Córdoba D, Priego-Capote F. Fully automated method for quantitative
determination of steroids in serum: An approach to evaluate steroidogenesis[J]. Talanta, 2021,
224: 121923.
