ICS07.080 CCS B43 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5667—2024 哺乳动物物种鉴定方法测序法 Mammalianspeciesidentificationmethod—Sequencingmethod 2024-12-31发布2025-07-01实施中华人民共和国海关总署发布前言本文件按照GB 1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、上海科技大学、上海动物园。 本文件主要起草人:蔡一村、宋蓉蓉、王艳、王瑛、林颖峥、冯之航、刘群秀、薛俊欣、张强、熊炜、李树清、 潘良文、李健、袁耀华、赵简。 Ⅰ SN/T5667—2024 哺乳动物物种鉴定方法测序法 1 范围本文件描述了哺乳动物物种成分双脱氧法(Sanger)和高通量测序鉴定方法。 本方法适用于哺乳动物的毛、皮、肉、血、骨、体液等单一或混合来源的动物及动物制品物种成分定性检测。 2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 30989—2014 高通量基因测序技术规程 GB 35918—2018 动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 3.1 序列相似性 sequencesimilarity 反映序列间相似程度的数值,是判定同源性关系的依据。 注:序列间相似度越高,提示两序列间同源可能性越高。 3.2 序列比对 sequencealignment 将待测序列与DNA 序列库进行比较。 3.3 Sanger测序法 sangersequencing 双脱氧链终止法,以单链或双链DNA 为模板,在DNA 聚合酶的催化下延伸结合在模板上的引物,直到掺入一种链终止核苷酸为止。每个反应含有4 种dNTP,并混入用同位素或荧光标记的 ddNTP,使延长的寡聚核苷酸选择性终止,通过高分辨率变性毛细管电泳分离片段获得碱基顺序的方法。 3.4 高通量测序 high-throughputgenesequencing 区别于传统Sanger(双脱氧法)测序,能一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术。 注:通常一次测序反应能产出不低于100Mb的测序数据。 4 缩略语下列缩略语适用于本文件: 1 SN/T5667—2024 BLAST:基于局部比对算法的搜索工具(basiclocalalignmentsearchtool); DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid); EDTA :乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid); NCBI:美国生物技术信息中心(Nationalcenterforbiotechnologyinformation); PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction); RNA:核糖核酸(ribonucleicacid); SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)。 5 试剂和材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水符合GB 6682的要求。所有试剂均使用无DNA 酶污染的容器存储或分装。 5.1 DNA 提取试剂 5.1.1 0.5mol/L(pH8.0)EDTA 溶液。 5.1.2 裂解液,配制方法见附录A。 5.1.3 苯酚。 5.1.4 三氯甲烷与异戊醇混合液(按24∶1的比例混合)。 5.1.5 蛋白酶K(20mg/mL)。 5.1.6 75%乙醇。 5.2 PCR 扩增试剂 5.2.1 上游引物:序列5'-TAA-GAC-GAG-AAG-ACC-CTR-TGG-A-3'。 5.2.2 下游引物:序列5'-CGG-TCT-GAA-CTC-AGA-TCA-CGT-3'。 注:上游引物为简并引物,R=A/G。 5.2.3 用去离子水将每条引物配制成100μmol/L储存液,置-20 ℃以下冻存;使用时取适量配制成 10μmol/L工作液,避免反复冻融。 5.2.4 MasterMix(2×) 5.2.5 去离子水,应符合GB 6682的要求。 5.3 凝胶电泳试剂 5.3.1 琼脂糖电泳相关试剂。 5.3.2 GelRed核酸染料。 5.3.3 核酸标准分子质量Marker:推荐使用可以判定350bp左右片段大小的DNA marker。 6 仪器和设备 6.1 超净工作台。 6.2 电子天平,分度值0.1mg。 6.3 微量移液器。 6.4 高速台式冷冻离心机。 6.5 NanoDrop微量核酸蛋白测定仪。 6.6 PCR 仪。 2 SN/T5667—2024 6.7 水平电泳仪。 6.8 凝胶成像分析系统。 6.9 测序仪。 7 检测步骤 7.1 核酸提取 7.1.1 对于哺乳动物的毛、皮、肉、骨及其相关的固体样品,应充分研磨后取20mg作为被提取物;对于液体样品,如血液、精液、组织匀浆液等应充分振荡混匀,取50μL作为被提取物。置于1.5mL离心管中。 注:骨骼牙齿等样品要进行适当脱钙处理。使用0.5mol/L(pH8.0)EDTA 溶液对样品碎屑37 ℃孵育过夜,离心去上清。 7.1.2 加入600μL 裂解液(见A.1)和20μL蛋白酶K 溶液(见A.2),混匀,置56 ℃水浴1h(期间每 15min轻微振动混匀)或过夜。 7.1.3 待消化完全,冷却至室温,加入200μL乙酸铵溶液(见A.3),混匀,4 ℃冷却5min~10min,使蛋白质析出。 7.1.4 使用4℃,12000r/min(约13400g)离心10min,上清液转移至另一个1.5mL离心管中,于 4℃,12000r/min(约13400g)离心10min,取上清液至另一个洁净1.5mL离心管中,加等体积三氯甲烷与异戊醇混合液,轻轻摇匀,4℃放置15min。 7.1.5 4℃ 12000r/min(约13400g)离心10min沉淀DNA;弃上清,加1 mL75%乙醇,轻轻混匀,于4℃12000r/min(约13400g)离心5min,弃上清,晾干;干燥后加入50μL 去离子水溶解; DNA 样品置冰上备用,若需长期保存应置于≤-20℃保存。 注:也能采用经验证等效的商业化DNA提取纯化方法或试剂盒进行核酸提取纯化,具体参照说明书使用。 7.2 DNA 浓度和纯度的测定吸取DNA 提取液1μL,以去离子水作为空白对照,使用微量核酸蛋白测定仪测定DNA 模板的质量浓度及A260/A280比值。DNA 的质量浓度根据式(1)计算: DNA 的质量浓度(ng/μL)=A260 ×50× 稀释倍数…………………(1) 提取的DNA 质量浓度要求大于或等于5ng/μL,A260/A280的比值在1.7~1.9之间。不达标应重新提取核酸。 7.3 对照和平行设置检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照、空白对照。用已知含哺乳动物成分的样品作阳性对照,用已知植物样品核酸作阴性对照,用等体积的双蒸水代替模板作为空白对照。 7.4 PCR 反应体系在冰上配置50μL反应体系,见表1。 3 SN/T5667—2024 表1 PCR 反应体系试剂工作液浓度加样量/浓度 MasterMix 2× 25μL primer-F 10μmol/L 2μL (10μmol/L) primer-R 10μmol/L 2μL (10μmol/L) DNA模板— 1μL~5μL (20ng/μL~100ng/μL) 去离子水— 补足50μL体系注:最终反应体系中试剂添加的种类和总体系体积可能会根据不同的PCR 试剂产生差异。进行不同体系配置时,需参照不同试剂使用说明书。 7.5 反应程序将已加样的PCR反应管短暂离心后放入PCR仪,扩增反应条件设定:95℃预变性2min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环;72℃5min;4℃保存。 注:根据不同PCR酶的要求,对反应程序中循环(扩增)步骤进行相应等效修改。 7.6 琼脂糖电泳用1×TAE电泳缓冲液配制含0.1μL/mLGelRed的2%琼脂糖凝胶。取5μL扩增产物点样后进行电泳检测,设DNA Marker进行同步电泳;采用120V 电压,电泳30min,用凝胶成像仪或紫外透射仪观察,拍照记录结果。不同物种扩增出的目的条带大小在350bp左右略有变化。 7.7 测序 7.7.1 将阳性扩增产物进行测序。 7.7.2 针对单一物种样品使用Sanger测序法采集扩增产物序列遗传信息。具体试验参照GB 35918— 2018进行。 7.7.3 针对混合物种样品使用高通量测序技术对扩增产物序列遗传信息进行同时采集。具体试验参照GB 30989—2014进行。 注:建议送专业测序公司完成测序试验。 7.8 序列比对 Sanger测序和高通量测序采集的序列信息,使用BLAST 程序与NCBI数据库中的物种序列信息进行比对。具体分析步骤参照附录B和附录C进行。 8 结果判断与表述 8.1 有效性原则以下条件需要同时满足,否则本次试验不成立: ———空白对照:无特异性条带; ———阴性对照:无特异性条带; ———阳性对照:有显著条带且大小在350bp左右。 4 SN/T5667—2024 8.2 结果判断 8.2.1 根据序列比对结果进行种物种类判定,序列相似性超过97.0%且相似性最高的可判定为所检测样品物种。 8.2.2 如果Sanger测序成功且测序结果与GenBank数据库中某物种序列相似性≥97.0%且相似性最高,检测结果表述为“样品检出××(例如牛)物种成分”。 8.2.3 如果高通量测序成功,则根据测序数据分析报告判断物种种类(分析方法参考附录C)。检测结果表述为“样品检出××(例如牛)、××(例如羊)成分和××(例如猪)”。 注:如果由专业高通量测序公司完成的测序试验,则根据公司出具的数据分析报告中的结果直接判断物种成分。 8.2.4 如果样品PCR 扩增阴性或PCR 扩增阳性,但序列相似性<97.0%,则重复试验。若再次检测后,相似性≥97.0%,则检测结果判定为相似性最高的物种;若PCR 扩增仍为阴性或PCR 扩增阳性,但序列相似性仍小于97.0%,则本方法不适用于该样品。 5 SN/T5667—2024 附录 A (规范性) 试剂配制 A.1 裂解液 1mol/LTris-HCl(pH8.0) 1mL 0.5mol/LEDTA 1mL 0.5mol/LNaCl 20mL 10% SDS 10mL 加去离子水定容至100mL。 A.2 蛋白酶K 溶液(20mg/mL) 将200mg蛋白酶K加入9.5mL水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解。不应涡旋混合。加去离子水定容到10mL,然后分装成小份,置于-20℃保存。 A.3 乙酸铵溶液(7.5mol/L) 称取578.12g乙酸铵,加去离子水定容到1L。 6 SN/T5667—2024 附录 B (资料性) Sanger测序结果序列分析比对步骤 Sanger测序数据直接与NCBI的序列数据库进行比对,具体操作如下。 a) 首先打开https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网页,选择红框中的NucleotideBLAST。 b) 将测序后的序复制粘贴到下图红框中的位置,不用修改任何设定值,点击下方的BLAST 按钮。 7 SN/T5667—2024 c) 待在线程序运行完毕,根据比对结果判断物种种类。第一个红框内的序列长度大于300bp,则认为比对长度有效。红框显示的序列相似度≥97.0%,可以直接根据相似度最高的结论判断种类。若相似度≥97.0%时系统给出两个或以上的物种,需参考形态学特征进行综合判断。 序列相似度<97.0%,可以重新测序后再进行比对判断,如果结果相似度还是没有 ≥97.0%,则不能进行种类的判断。 8 SN/T5667—2024 附录 C (资料性) 高通量测序数据分析质控后与NCBI的序列进行比对,具体操作如下。 a) 根据重叠片段信息,利用PEAR(v0.9.6)软件进行Illu分钟a短片段组装。然后对fastq文件进行处理,生成相应的fasta和qual文件,便于在后续的标准化数据比较分析过程中使用。 b) 使用Cutadapt 软件(v1.2.1,https://pypi.org/project/cutadapt/1.2.1/)和Prinseq 软件 (v0.20.4,http://prinseq.sourceforge.net/)修剪长度小于200bp或大于350bp的序列,去除含有歧义碱基的序列并利用UCHIME(v4.2.40,http://drive5.com/usearch/manual/uchime _algo.html)、Usearch(version5.2.236,http://www.drive5.com/usearch)和BLASTN 去除扩增过程中产生的嵌合序列。 c) 最后使用Usearch(version5.2.236,http://www.drive5.com/usearch/)将所有干净的数据聚类到OperationalTaxonomicUnits(OTU)。使用BLASTN 将每个OTU 中丰度最高的序列与数据库进行比对。序列的相似性和覆盖率均满足≥95%的,用于后续分类。不满足条件或有效比例<0.5%的序列认定为未检出标记为未分类。 注:如果高通量测序试验外委托商业化公司进行,这部分生物信息学分析步骤由公司完成,根据最后出具的试验报告对物种信息进行确定。 9 SN/T5667—2024
