T/QHNX 059-2026 甘蓝型春油菜小孢子培养及加倍技术规范

　　ICS 65.020.20 CCS B 05

　　T/QHNX

　　团 体 标 准

　　T/QHNX 059—2026

　　T/QAS 171—2026

　　甘蓝型春油菜小孢子培养及加倍技术规范

　　2026 - 04 - 09 发布 2026 - 04 - 15 实施

　　青海省农学会 发 布

　　T/QHNX 059—2026

　　T/QAS 171—2026

　　前 言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由青海大学农林科学院提出。

　　本文件由青海省农学会归口。

　　本文件起草单位：青海大学农林科学院、青海互丰农业科技集团有限公司、青海省农业技术推广总站。

　　本文件主要起草人：星晓蓉、叶景秀、赵志、李开祥、徐亮、柳海东、贺子腾、许永丽。

　　T/QHNX 059—2026

　　T/QAS 171—2026

　　甘蓝型春油菜小孢子培养及加倍技术规范

　　1 范围

　　本文件规定了甘蓝型春油菜小孢子培养术语和定义，以及供体种植条件、供体种植及取样、培养基的配置及灭菌、小孢子培养方法、再生植株加倍等技术内容的操作规范及质量要求。

　　本文件适用于甘蓝型春油菜区育种时使用。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　DB63/T 943 甘蓝型油菜主要病虫害防治技术规范

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3. 1

　　小孢子(Micrre)

　　高等植物花粉形成过程中，由花粉母细胞经过减数分裂产生的单倍体细胞。

　　3.2

　　胚状体(Embryo id)

　　通过离体小孢子培养诱导形成的类胚结构。

　　3.3

　　再生植株(Regenerated plant)

　　由胚状体发育而成的完整植株。

　　4 供体种植条件

　　供体可种植在大田、温室、人工气候室等场所。大田具备基本的种植土壤及浇灌条件;温室具备供暖、保温、通风、浇灌设备;人工气候室具备精确的控温、控光系统。

　　5 供体种植及取样

　　5.1 供体种植

　　5.1.1 大田

　　大田供体材料从3月~5月分批播种，每批材料种植间隔15d，水肥统一管理，病虫害防治按DB63/T 943规定进行。

　　5.1.2 温室

　　温室从9月中下旬开始种植，温度控制在15℃~25℃, 12月中旬开花时，温度控制在8℃~15℃。水肥统一管理，病虫害防治按DB63/T 943规定进行。

　　5.1.3 人工气候室

　　人工气候室全年种植，开花时，温度控制在10℃~18℃。昼/夜温度设定为18/10℃。水肥统一管理，病虫害防治按DB63/T 943规定进行。

　　T/QHNX 059—2026

　　T/QAS 171—2026

　　5.2 取样

　　5.2.1 取材时间

　　供体植株初花至盛花期取样，选取健康植株的主花序或生长状态较好的分支花序，用冰盒运送至培养基地。

　　5.2.2 小孢子发育时期确定

　　选取大小2.5 mm~3.2 mm 的花蕾。通过镜检，选取单核晚期至双核早期的小孢子。

　　5.2.3 花蕾消毒

　　a) 用有效氯成分 4.5%~5.5%的消毒液(84 液)，表面消毒 15 min，然后用无菌水清洗 3 次，每

　　次 5 min。

　　b) 用 75%的酒精表面消毒 1min，再用升汞消毒 8~10min，最后用无菌水清洗 3 次，每次 5 min。

　　6 培养基的配置及灭菌

　　6.1 配置

　　见附录A。

　　6.2 灭菌

　　6.2.1 抽滤灭菌

　　NLN-13培养基应抽滤灭菌。先用真空泵和抽滤罐，分别用0.8 m，0.22 m孔径的混合纤维素酯膜(MCE)对培养基进行初步过滤，再通过无菌过滤器和蠕动泵，过滤、分装到无菌容器中，25℃静置24h后使用。

　　6.2.2 高温高压灭菌

　　B5-13 、B5 、MS培养基，应采用高温高压灭菌，121℃, 103.4kPa ，20min。

　　7 小孢子培养方法

　　7.1 小孢子提取

　　步骤如下：

　　1) 将表面清洗消毒后的花蕾放置于离心管中，加入 30mL~40mLB5-13 分离洗脱培养基，用玻璃棒研磨使花粉散出。

　　2) 将花粉悬浮液倒入过滤器(小漏斗和 300 目尼龙纱网组成)，滤入 50ml 离心管。

　　3) 800~1000 rpm/min，离心 4min，弃上清液，再加入 30mL~40mLB5-13 洗脱液，重复洗脱至少 2 次。

　　7.2 胚诱导培养

　　步骤如下：

　　1) 用NLN-13 培养基将收集到小孢子进行稀释，并分装到 9 cm培养皿中，每皿 15mL~20mL，用封口膜封口。

　　2) 32℃黑暗热激培养 48h，然后静置在25℃恒温条件下进行暗培养。

　　3) 10~12d 左右肉眼可见胚状体形成，移至 50 rpm/min 、25℃恒温摇床上继续进行振荡暗培养。

　　7.3 胚状体冷处理

　　将发育至5mm~10mm的子叶型胚放置在4℃条件下，处理20d。

　　7.4 再生植株的诱导培养

　　T/QHNX 059—2026

　　T/QAS 171—2026

　　将经过低温处理的子叶型胚接种在B5固体培养基上，于25℃, 16 h光/8 h暗，2000 LUX光强条件下培养。

　　7.5 再生植株的继代培养

　　切取胚状体上的再生植株的生长点，接种在MS固体培养基上继代培养。

　　8 再生植株加倍

　　8.1 土壤基质

　　再生苗移植前施肥，平均每亩施有机肥160.00kg/667m2。

　　8.2 栽培及壮苗

　　再生苗在MS培养基上生长30d后，可移栽到温室土壤中。移栽初期需要用遮阴网和透明塑料杯遮光、保湿。练苗15d后，揭开遮阴网和杯子，使其在自然光照下生长。单倍体植株长出3~5片新叶时，进行染色体加倍。

　　8.3 单倍体苗加倍

　　将植株挖出，洗净根部泥土，在浓度0.3%的秋水仙碱溶液中，浸根7h。然后，将植株根部残留的秋水仙碱用流水冲洗干净，重新栽种到土壤中，灌透水，并遮光、缓苗。

　　8.4 施肥管理

　　缓苗15d后，取开遮阴网，松土、除草、去黄叶、死叶，并追施尿素3.00kg/667m2。开花后，及时拔除未能加倍的植株，再追施尿素4.00kg/667m2 ，加倍正常植株套袋留种。

　　8.5 病虫害防治

　　主要病害为白粉病，虫害为小菜蛾和蚜虫，防治方法按DB63/T 943执行。

　　T/QHNX 059—2026

　　T/QAS 171—2026附 录 A

　　(规范性)

　　培养基配方

　　培养基配方见表A.1

　　表A.1 培养基配方表