T/CVMA 353-2026 边缘无浆体荧光PCR检测方法

　　ICS 11.220 CCS B 41

　　团 体 标 准

　　T/CVMA 353—2026

　　边缘无浆体荧光 PCR 检测方法

　　Real-time PCR method for detection of Anaplasma marginalea

　　2026 - 3 - 4 发布 2026 - 3 - 4 实施

　　中国兽医协会 发 布

　　T/CVMA 353—2026

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由河南农业大学提出。

　　本文件由中国兽医协会归口。

　　本文件起草单位：河南农业大学、塔里木大学、西北农林科技大学、信阳市畜牧兽医技术服务中心、郑州中道生物技术有限公司。

　　本文件主要起草人：李俊强、张龙现、王荣军、齐萌、赵光辉、胡建新、任宝红、赵金凤、杜海利、宁长申、菅复春、张素梅、朱子奇、廖培琪、马超锋、李晓迎、毋亚运、李森阳、许会艳。

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　　边缘无浆体荧光 PCR 检测方法

　　1 范围

　　本文件规定了边缘无浆体的荧光定量PCR检测方法及结果判定等操作要求。

　　本文件适用于边缘无浆体的检测、流行病学调查及检疫。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　GB/T 27401 实验室质量控制规范 兽医学检测

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　BHQ：无荧光淬灭基团(black hole quencher)

　　BSL：生物安全防护实验室(animal biosafety laboratory)

　　bp：碱基对(base pair)

　　Ct值：每个管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cycle threshold)

　　ddH2O：双蒸水(double-distilled H2O)

　　DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　FAM：6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein)

　　MSP1β：主要表面蛋白1β(major surface protein 1β)

　　PBS：磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline buffer)

　　qPCR：荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR)

　　5 主要仪器与设备

　　5.1 荧光定量 PCR 仪。

　　5.2 微量可调移液器及配套吸头(0.1 μL ~ 2.5 μL，0.5 μL ~ 10 μL，10 μL ~ 100 μL，100 μL ~ 1000 μL)。

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　　5.3 漩涡振荡器。

　　5.4 台式离心机。

　　5.5 高压蒸汽灭菌器。

　　5.6 生物安全柜或超净台。

　　6 试剂与耗材

　　6.1 除非另有说明，检测中所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求。

　　6.2 血液基因组 DNA 提取试剂盒(市售产品，可选择同类产品替代)。

　　6.3 qPCR 扩增专用酶试剂盒(市售产品，可选择同类产品替代)。

　　6.4 引物和探针。参照边缘无浆体 MSP1β 蛋白基因位点参考序列(见附录 A)，设计边缘无浆体荧光PCR 扩增特异性引物及探针序列，见附录 B。

　　6.5 阳性对照：已经鉴定的边缘无浆体 DNA 样品。

　　6.6 阴性对照：灭菌双蒸水。

　　7 样品的采集、保存及运送

　　7.1 样品的采集

　　应按照 GB/T 27401 的相关要求进行采样。具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员操作，确定采血部位，针对家畜类动物，在颈静脉或尾静脉处，使用无菌采血器具和抗凝真空采血管(含 EDTA)采集约 3 mL 血液，采血前后进行局部消毒，采血过程中应避免样本交叉污染。每份样本应标记编号、动物种类、年龄、品种、采样时间、采集地点等信息。

　　7.2 样本的保存与运输

　　采集的血液样品，在 2 ℃ ~ 8 ℃的条件下保存应不超过 24 h，长期保存需置于-20 ℃冻存。

　　长距离运输的样品应先置于密封不透水、防泄漏容器内，再将容器放入具有防压、不透水及防泄漏功能的辅助包装中，最后在周围放置医用冰袋或冷冻制剂，以确保样本维持低温状态。样本应尽快送达检测实验室，最迟不超过 48 h。

　　7.3 样本处理的生物安全要求

　　应按照GB 19489的相关要求，在生物安全2级(BSL-2)实验室中进行检测工作，检测后的样品的处理应按照GB/T 27401中有关规定进行处理。

　　8 操作方法

　　8.1 DNA 制备

　　8.1.1 使用商品化血液 DNA 提取试剂盒，从血液样品中提取 DNA，按照试剂盒说明书进行操作，确保提取 DNA 的质量与纯度。

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　　8.1.2 提取的 DNA 样品，应立即进行荧光 PCR 扩增。若当前无法进行试验，可存放至-20 ℃条件下保存。

　　8.2 荧光 PCR 检测

　　8.2.1 荧光 PCR 反应体系

　　边缘无浆体荧光 PCR 反应体系，以提取的 DNA 为模板，将所有试剂、引物加入 PCR 反应管，具体配置见附录 C 中表 C.1。

　　8.2.2 荧光 PCR 反应程序

　　边缘无浆体荧光 PCR 反应程序见附录 C.2。

　　9 结果判定

　　9.1 试验成立条件

　　9.1.1 阴性对照：无 Ct 值或无典型的 S 型扩增曲线;

　　9.1.2 阳性对照： Ct 值≤30，且扩增曲线为典型的 S 型;

　　9.1.3 以上要求需在同一次试验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。

　　9.2 结果描述及判定

　　9.2.1 阳性

　　试验成立条件下，被检样品检测结果中 Ct 值≤35，且出现对数扩增曲线，判定为边缘无浆体核酸阳性。

　　9.2.2 阴性

　　试验成立条件下，被检样品无 Ct 值或 Ct 值>38，判定为边缘无浆体核酸阴性。

　　9.2.3 可疑

　　当被检样品检测结果中35

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　边缘无浆体 MSP1阝 蛋白基因位点参考序列

　　A.1 边缘无浆体MSP1阝蛋白基因位点片段参考序列(GenBank Accession No. PP798377.1)

　　5´-AGAATTTGGCAAGGCAGCAGCCTGGGGTCTAGCAGGTTTCAAGCGTACAGTGGATGAAA GCCTGGAGATGTTAGACCGAGGCATGCACATGCTCGCGGAAGGCCAGGCACAGATATCAGAGGGG ATTAACGCCAAGGATACTGCACTAGTTAGGGAAGGTCTGGA-3´

　　注：下划线部分为目标检测片段;加粗体为引物序列;斜体为探针序列。

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　边缘无浆体荧光 PCR 扩增特异性引物和探针序列

　　边缘无浆体荧光PCR扩增特异性引物和探针序列见表B.1。

　　表B.1 毕氏肠微孢子虫巢氏PCR引物序列

　　注：上下游引物和探针工作浓度均为10 μM。

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　边缘无浆体荧光 PCR 反应

　　C.1 边缘无浆体荧光PCR反应体系

　　荧光 PCR 扩增反应体系见表 C.1。

　　表C.1 荧光PCR扩增反应体系(25 μL)

　　C.2 边缘无浆体荧光PCR反应程序

　　荧光 PCR 扩增反应程序见表 C.2。

　　表C.2 荧光PCR扩增反应程序

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