范围
规范了采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术检测脂溶性维生素的实验要求、方法学验证、质量管理和结果报告。
适用对象：25-羟基维生素 D₂/D₃、视黄醇（VA）、α-生育酚（VE）、叶绿醌（VK₁）。
二、核心要求
1. 实验基本要求
- 实验室环境：符合GB/T 20469和YY/T 1740.1-2021（温湿度、洁净度、防干扰）。
- 人员资质：需医学检验/分析化学背景，经培训考核合格。
- 设备要求：LC-MS/MS设备符合YY/T 1740.1性能标准。
- 样本管理：
- 采集：避光采样管，血清样本（避免分离胶干扰）。
- 保存：2~8℃避光保存≤28天，-20℃以下长期保存。
- 试剂耗材：色谱级试剂，耗材需验证无目标物干扰。
2. 方法学建立
- 标准品与内标（IS）：
- 标准品纯度≥98.5%，优先使用有证参考物质。
- IS推荐稳定同位素标记物（如VA-d6），标记纯度>98%。
- 色谱质谱参数：
- 色谱柱：优化分离效果（如C18柱）。
- 离子源：250HD/VA/VE建议ESI源，VK₁建议APCI源。
- 质谱优化：调谐母离子/子离子对（每个化合物至少2个离子通道）。
三、方法学验证
关键性能指标
| 参数 |
要求 |
| 精密度 |
定量下限浓度CV≤20%，其余浓度CV≤15% |
| 正确度 |
250HD₃偏差≤±12.5%，其余≤±20%；回收率85%~115% |
| 线性范围 |
250HD₂/D₃: 0.5–200 ng/mL；VA: 25–5000 ng/mL；VE: 250–50,000 ng/mL；VK₁: 0.05–20 ng/mL |
| 定量下限 |
信噪比≥10，CV≤20%，偏差≤20% |
| 基质效应 |
不同基质偏差≤20%（验证方法：提取后加标/柱后灌注/混合实验） |
| 携带污染 |
高浓度样本后空白残留≤定量下限的20%且≤IS的5% |
| 特异性 |
干扰物（血红蛋白、胆红素等）导致的偏差≤20% |
四、质量管理
1. 室内质控
- 质控品：3个浓度（定量下限附近、医学决定水平、定量上限附近），每批检测。
- 规则：Levy-Jennings质控图，多规则判读（如1₃ₛ/2₂ₛ）。
- 失控处理：检查色谱峰形、保留时间漂移、信号强度等。
2. 室间质评
- 参加EQA计划，或与外部实验室比对（偏差要求：250HD≤±15%，其余≤±20%）。
3. 系统适用性测试
- 每批检测前验证：保留时间偏差≤±0.2 min，化合物与IS峰面积比CV≤15%。
五、操作流程（附录A）
1. 样本前处理（液液萃取法）
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A[取100μL血清] --> B[加10μL IS工作液]
B --> C[加200μL乙腈沉淀蛋白]
C --> D[加900μL正己烷萃取]
D --> E[离心取有机层]
E --> F[氮吹干燥]
F --> G[复溶于80μL 80%乙腈]
取100μL血清
加10μL IS工作液
加200μL乙腈沉淀蛋白
加900μL正己烷萃取
离心取有机层
氮吹干燥
复溶于80μL 80%乙腈
2. 色谱条件
- 流动相：
- A相：0.1%甲酸水溶液
- B相：0.1%甲酸甲醇溶液
- 梯度洗脱：优化分离（如5%~95%B相，8min）。
六、结果报告
- 发布条件：满足线性、质控、色谱峰形要求。
- 计算：以待测物与IS峰面积比对标曲（加权回归r²≥0.990）。
七、规范性引用文件
- GB/T 20469、YY/T 1740.1、WS/T 478-2024等12项国家标准/行业指南。
注：本标准由协和医院牵头，联合23家单位制定，强调方法标准化与结果可比性，为临床脂溶性维生素检测提供技术依据。
