T/CIQA 114-2025 虾肝肠胞虫病原体快速鉴别 CRISPR法

​​虾肝肠胞虫病原体快速鉴别CRISPR法（T/CIQA 114-2025）主要内容总结​​

​​1. 范围​​

• 本文件规定了虾肝肠胞虫病（Enterocytozoon hepatopenaei disease, EHP）的快速检测方法，基于重组酶介导扩增（RAA）结合CRISPR技术。
• 适用于对虾（如南美白对虾、斑节对虾）及其相关样本（受精卵、幼体、组织、粪便等）中EHP病原体的检测。

​​2. 规范性引用文件​​

• 无直接引用其他标准，但遵循GB/T 1.1-2020的起草规则。

​​3. 缩略语​​

• 关键术语包括：
  • ​​crRNA​​：CRISPR识别RNA序列。
  • ​​CRISPR​​：规律间隔成簇短回文重复序列。
  • ​​EHP​​：虾肝肠胞虫。
  • ​​RAA/RPA​​：重组酶介导/聚合酶扩增技术。
  • ​​SWP​​：EHP的胞子壁蛋白基因（检测靶标）。

​​4. 检测原理​​

1. ​​DNA提取​​：从虾组织样本中提取基因组DNA。
2. ​​RAA扩增​​：特异性扩增EHP的SWP基因片段。
3. ​​CRISPR-Cas12a识别​​：
   • Cas12a酶在crRNA引导下结合RAA扩增产物。
   • 结合后激活Cas12a的非特异性切割活性，切割荧光探针（FAM标记），释放荧光信号。
4. ​​信号检测​​：通过酶标仪（494-525 nm）定量荧光强度，判定EHP是否存在。

​​5. 试剂与材料​​

• ​​DNA提取试剂盒​​：含组织消化液、磁珠、漂洗液等。
• ​​RAA扩增试剂盒​​：含反应干粉、缓冲液、引物（靶向SWP基因）。
• ​​CRISPR组分​​：
  • LbCas12a酶（商业化产品）。
  • crRNA（特异性识别RAA产物）。
  • 荧光探针（FAM-TTA-TT-BHQ1）。
• ​​对照样本​​：阳性对照（EHP DNA）、阴性对照（健康虾DNA）、空白对照（无核酸酶水）。

​​6. 仪器设备​​

• 水浴锅/金属浴（37℃恒温反应）、手掌离心机、电动匀浆机、酶标仪（荧光检测）、磁力架（DNA提取）。

​​7. 临床症状​​

• 感染EHP的对虾表现为：
  • 肝胰腺和肠道颜色加深，肝胰腺萎缩。
  • 生长缓慢，个体大小差异显著，体重仅为健康群体的70%。
  • 摄食正常，无急性死亡，易被忽视。

​​8. 采样方法​​

• ​​样本类型​​：
  • 幼体/仔虾：全个体。
  • 成虾：头胸部（肝胰腺、鳃、心脏）、肠道或粪便。
• ​​保存​​：-20℃暂存或立即提取DNA。
• ​​对照设置​​：阳性、阴性、空白对照需同步检测。

​​9. 实验步骤​​

1. ​​DNA提取​​：
   • 组织匀浆→消化→磁珠纯化→洗脱。
2. ​​RAA扩增​​：
   • 37℃反应30分钟，扩增SWP基因片段。
3. ​​CRISPR检测​​：
   • 将RAA产物与Cas12a、crRNA、荧光探针混合，37℃孵育60分钟。
   • 酶标仪读取荧光信号。

​​10. 结果计算​​

• ​​判定值（N）​​：

  N = \frac{\text{样品10分钟荧光值/对照10分钟荧光值}}{\text{样品2分钟荧光值/对照2分钟荧光值}}  

• ​​Cut-off值​​：
  • ​​阳性​​：N ≥ 1.40。
  • ​​阴性​​：N ≤ 1.20。
  • 1.20 < N < 1.40需复检。

​​11. 质量控制​​

• ​​空白对照​​：无荧光增长（否则实验无效）。
• ​​阴性对照​​：N ≤ 1.20。
• ​​阳性对照​​：N ≥ 1.40且荧光显著增长。

​​12. 结果判定​​

• ​​检出EHP​​：样品荧光值与对照有显著差异（N ≥ 1.40）。
• ​​未检出EHP​​：样品与对照无差异（N ≤ 1.20）。

​​13. 防污染措施​​

• 按GB/T 27403-2008附录D执行，防止PCR产物交叉污染。

​​其他关键信息​​

• ​​知识产权​​：归中国出入境检验检疫协会所有，禁止商业用途转载。
• ​​起草单位​​：南京师范大学、盐城师范学院等机构联合制定。
• ​​特异性​​：靶向EHP的SWP基因，引物和crRNA序列明确（表1）。

​​总结​​

该标准提供了一种高灵敏度、高特异性的EHP检测方法，结合RAA快速扩增和CRISPR-Cas12a的荧光信号放大技术，适用于对虾养殖、检疫中的病原体筛查，强调质量控制与防污染措施，确保结果可靠性。