T/CIQA 112-2025 动物源性食品中牛、羊和猪源性成分定性检测方法 CRISPR法

​​团体标准 T/CIQA 112-2025《动物源性食品中牛、羊和猪源性成分定性检测方法 CRISPR法》主要内容总结​​

​​1. 范围​​

• 本标准规定了基于CRISPR技术对动物源性食品（如肉类）中牛、羊和猪源性成分的​​定性检测方法​​。
• 适用于食品中上述物种成分的筛查，不涉及定量分析。

​​2. 规范性引用文件​​

• 引用多项国家标准和行业标准，包括：
  • GB/T 6682（实验室用水要求）
  • GB/T 27403-2008（食品分子生物学检测质量控制）
  • GB/T 24777-2009（实验室安全要求）
  • SN/T 5624-2023（检测实验室风险管理）

​​3. 缩略语​​

• 关键术语解释：
  • ​​CRISPR​​：规律间隔成簇短回文重复序列（基因编辑技术核心）。
  • ​​crRNA​​：引导Cas12a酶靶向切割的RNA序列。
  • ​​RPA​​：重组酶聚合酶扩增（用于快速核酸扩增）。

​​4. 检测原理​​

1. ​​RPA扩增​​：针对牛、羊、猪的线粒体细胞色素b（cytb）基因设计特异性引物，扩增目标DNA片段。
2. ​​CRISPR切割​​：使用Cas12a酶和crRNA识别扩增产物，切割后释放荧光信号（探针：FAM-BHQ1）。
3. ​​荧光检测​​：通过酶标仪（494-525 nm）读取荧光增量，判定物种成分是否存在。

​​5. 试剂与材料​​

• ​​关键试剂​​：
  • 裂解液（含CTAB、Tris-HCl等，用于DNA提取）。
  • RPA试剂盒（含扩增缓冲液、醋酸镁）。
  • Cas12a酶（商业化产品，如NEB的EnGen® Lba Cas12a）。
  • 特异性引物、crRNA及荧光探针（序列详见表1）。
• ​​对照设置​​：需包含空白对照（水）、阴性对照（不含目标物种的样品）、阳性对照（含目标物种的样品）。

​​6. 仪器与耗材​​

• 主要设备：酶标仪、恒温水浴锅、离心机、微量移液器、涡旋振荡器。

​​7. 样品制备​​

• 取样50 mg肉类组织，-20℃保存或立即提取DNA。
• ​​DNA提取步骤​​：
  1. 裂解（65℃, 30 min）→ 离心取上清。
  2. 氯仿/异戊醇抽提→异丙醇沉淀→乙醇洗涤→溶解DNA。

​​8. 实验步骤​​

1. ​​RPA扩增​​（37℃, 20 min）：
   • 体系含引物、DNA模板、RPA缓冲液、醋酸镁。
2. ​​CRISPR反应​​（37℃, 30 min）：
   • 体系含Cas12a、crRNA、荧光探针、RPA产物。
3. ​​荧光检测​​：酶标仪读取10 min和2 min的荧光值，计算判定值N。

​​9. 结果计算与判定​​

• ​​公式​​：
  N = \frac{\text{10 min样品荧光值/对照荧光值}}{\text{2 min样品荧光值/对照荧光值}}
• ​​cut-off值​​：
  • N ≥ 1.40：阳性（检出目标物种）。
  • N ≤ 1.20：阴性（未检出）。
  • 1.20 < N < 1.40：需复测。

​​10. 质量控制​​

• 空白对照：无荧光增长。
• 阴性/阳性对照：需符合预期结果，否则实验无效。

​​11. 结果报告​​

• 阴性样品：报告“未检出”。
• 阳性样品：需确证后报告“检出”。

​​12. 防污染措施​​

• 按GB/T 27403-2008要求，防止PCR产物交叉污染（如分区操作、耗材灭菌）。

​​附录A（资料性）​​

• 提供牛、羊、猪的cytb基因RPA扩增参考序列，用于引物设计验证。

​​标准特点​​

• ​​技术先进性​​：结合RPA（快速扩增）和CRISPR（高特异性），提升检测灵敏度。
• ​​标准化​​：明确试剂、仪器、步骤及质控要求，确保结果可靠性。
• ​​应用场景​​：适用于进出口检验、食品安全监管等领域，快速筛查肉类掺假。

（注：本标准知识产权归中国出入境检验检疫协会所有，未经许可不得商用。）