T/NAIA 0368-2025 葡萄酒中4种黄酮类物质的测定 高效液相色谱-串联质谱法

ICS 67.160.10
CCS C 151
T/NAIA
团 体 标 准
T/ NAIA 0368—2025
葡萄酒中4 种黄酮类物质的测定
高效液相色谱-串联质谱法
Determination of 4 Flavonoids in Wine by Liquid
Chromatography-Tandem Mass Spectrometry(LC-MS/MS)
2025-03-10 发布 2025-03-31 实施
宁夏化学分析测试协会 发 布
I
前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》规定
编写。
本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。
本文件起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院（国家市场监督管理总局重点实验室（枸杞
及葡萄酒质量安全））、宁夏化学分析测试协会。
本文件主要起草人：汤丽华、朱燕燕、岳苑、王泽岚、马雪梅、吕毅、李强、吴明、马桂娟、
张小飞。
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葡萄酒中4 种黄酮类物质的测定 高效液相色谱-串联质谱法
1 范围
本文件规定了葡萄酒中4 种黄酮类物质（槲皮素、烟花苷、芦丁、黄芩素）的液相色谱-串联质
谱检测方法。
本文件适用于葡萄酒中4 种黄酮类物质（槲皮素、烟花苷、芦丁、黄芩素）的测定。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 原理
试样经80%甲醇溶液涡旋超声提取，提取液经分散固相萃取净化，用高效液相色谱-串联质谱
仪检测，外标法定量。
5 试剂和材料
本方法所用的试剂，除另有规定外，均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。
5.1 试剂
5.1.1 乙腈：色谱纯。
5.1.2 甲醇：色谱纯。
5.1.3 甲酸：色谱纯。
5.1.4 十八烷基硅烷键合硅胶（C18）：40μm~60μm。
5.1.5 无水硫酸镁（MgSO4）粉末：粒径50μm。
5.1.6 N-丙基乙二胺（PSA）粉末:粒径50μm。
5.1.7 0.1%甲酸溶液：取甲酸（5.1.3）1.0mL，用水定容到1000mL，摇匀。
5.1.8 80%甲醇溶液：取甲醇（5.1.2）800mL，用水定容到1000mL，摇匀。
5.2 标准品
4 种黄酮类物质中英文通用名称、化学分子式、CAS 号、纯度见附录A。
5.3 标准溶液配制
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5.3.1 标准储备液（1.0mg/mL）：分别准确称取槲皮素、烟花苷、芦丁和黄芩素4 种黄酮类标准品
10mg（准确至0.1mg），用甲醇（5.1.2）分别溶解并定容至10.0mL，于-18℃避光保存。
5.3.2 混合标准中间液（10.0μg/mL）：分别准确吸取标准储备液（5.3.1）0.1mL，用甲醇（5.1.2）
定容至10.0mL，于-18℃避光保存。
5.3.3 混合标准工作溶液：分别准确吸取混合标准中间液（5.3.2）适量，用80%甲醇溶液（5.1.8）
配制成浓度为10.0 ng/mL~500.0 ng/mL 的标准工作液，临用现配。
6 仪器和设备
6.1 高效液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源(ESI)。
6.2 分析天平：感量0.01mg 和0.01g。
6.3 涡旋混合器。
6.4 离心机：转速不低于8000r/min。
6.5 超声波发生器。
6.6 有机微孔滤膜，孔径0.22μm，或性能相当者。
7 分析步骤
7.1 试样制备
取代表性样品2 瓶摇匀分装，冷藏保存。
7.2 测定步骤
吸取5.0mL 样品于50mL 离心管中，加入10mL80%甲醇溶液（5.1.8），涡旋振荡后超声5min，
8000r/min 离心5min。移取上清液2mL 至装有50mg C18（5.1.4）、100mg 无水硫酸镁（5.1.5）和
30mgPSA（5.1.6）的离心管中，涡旋混合2min，8000 r/min 离心5 min，有机滤膜（6.6）过滤后，
待测定。
7.3 仪器参考条件
7.3.1 液相色谱参考条件
a）色谱柱：C18 色谱柱，2.1mm×100mm，粒径3.5μm 或性能相当者。
b）柱温：40℃。
c）流动相：A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈；梯度洗脱见表1。
d）流速：0.3mL/min。
e）进样量：10μL。
表1 流动相及梯度洗脱条件
时间/min 流速/（mL/min） 流动相A/% 流动相B/%
0.00 0.3 95 5
1.00 0.3 95 5
5.00 0.3 50 50
7.00 0.3 5 95
9.00 0.3 5 95
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10.00 0.3 95 5
12.00 0.3 95 5
7.3.2 质谱参考条件
a）离子源：电喷雾离子源（ESI）。
b）扫描方式：负离子扫描。
c）检测方式：多反应监测（MRM）。
d）鞘气温度：300℃。
e）鞘气流速：6L/min。
f）雾化气压力：40psi。
g）喷嘴电压：500V。
h）毛细管电压：3500V。
i）定性离子对、定量离子对、碎裂电压、碰撞能量等参数参见附录B。
7.4 定性测定
经确证分析，被测物质色谱峰保留时间与标准物质相一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，
所选择的离子均出现。同时所选择离子的丰度比与标准溶液中相关离子的相对丰度一致，相似度在
允许偏差之内（见表2），则可判定样品中存在对应的被测物。
表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 ＞50% ＞20%至50% ＞10%至20% ≤10%
允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50%
7.5 定量测定
根据试液中被测物含量情况，选定浓度相近的标准混合使用液，标准混合使用液和待测试液中
被测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。基质标准混合使用液与试液等体积进样测定。标准
溶液及试液均按7.3.1 和7.3.2 规定的条件进行测定，如果试液中与标准溶液相同的保留时间有峰出
现，则对其进行确证。槲皮素、烟花苷、芦丁和黄芩素的定量离子对典型色谱图参见附录C，采用
外标法定量。
7.6 空白试验
除不加试样外，均按上述步骤进行。
8 结果计算
试样中4 种黄酮类物质的含量按式（1）进行计算：
( 1 )
1000
                          



m
X C V
式中：
X ──试样中各种化合物含量，单位为毫克每升（mg/L）；
C ──由标准曲线计算出的试样溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V ──试样的总体积，单位为毫升（mL）；
m ──试样体积，单位为毫升（mL）。
注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
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9 精密度
在重复性测定条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
10 其他
槲皮素、烟花苷、芦丁、黄芩素定量限均为0.03mg/L。
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附录 A
(资料性)
4 种黄酮类物质中英文通用名称、化学分子式、CAS 号、纯度
表A.1 4 种黄酮类物质中英文通用名称、化学分子式、CAS 号、纯度
中文通用名称 英文通用名称 化学分子式 CAS 号 纯度
槲皮素 Quercetin C15H10O7 117-39-5 ＞95%
烟花苷 Nicotiflorin C27H30O15 17650-84-9 ＞95%
芦丁 Rutin C27H30O16 153-18-4 ＞95%
黄芩素 Baicalein C15H10O5 491-67-8 ＞95%
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附录 B
(资料性)
4 种黄酮类物质的质谱参数
表B.1 4 种黄酮类物质的质谱参数
序号 被测物名称 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碎裂电压(v) 碰撞能量(ev)
1 槲皮素 301.1 178.9*,150.9 120 20,22
2 烟花苷 593.3 285.2*,255.1 175 34,48
3 芦丁 609.1 300.1*,255.1 200 40,60
4 黄芩素 269 167*,140.9 130 34,32
注：*为定量离子
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附录 C
(资料性)
4 种黄酮类的定量离子对典型色谱图
图C.1 4 种黄酮类的定量离子对典型色谱图