T/ZNZ 320-2025 《植物源性食用农产品中总花色苷含量的测定 分光光度法》 主要内容的详细总结：
1. 标准核心信息：
- 标准号： T/ZNZ 320-2025
- 标准名称： 植物源性食用农产品中总花色苷含量的测定 分光光度法 (Determination of total anthocyanin content in edible agricultural products of plant origin-Spectrophotometric method)
- 发布机构： 浙江省农产品质量安全学会
- 起草单位： 中国水稻研究所、农业农村部稻米及制品质量检验测试中心
- 主要起草人： 邵雅芳、朱大伟、牟仁祥、徐清宇、章林平、陈铭学
- 起草依据： GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》
- 专利声明： 文件的某些内容可能涉及专利，发布机构不承担识别责任。
2. 范围：
- 本文件规定了一种测定植物源性食用农产品中总花色苷含量的分光光度检测方法。
- 适用范围： 谷物、薯类、果蔬等植物源性食用农产品。
3. 规范性引用文件：
- GB/T 6682 《分析实验室用水规格和试验方法》（引用的是一级水）。
4. 术语和定义：
- 花色苷 (Anthocyanin): 定义为花青素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，能使植物呈现由红、紫红到蓝等不同颜色。
5. 原理：
- 利用花色苷的结构和吸光特性随pH值变化的特点。
- pH=1.0时： 花色苷以红色的2-苯基苯并吡喃形式存在，在520nm波长处有最大吸收。
- pH=4.5时： 花色苷以无色的甲醇假碱形式存在，在520nm处吸收显著降低或消失。
- 在700nm波长处测量背景干扰。
- 分别测定待测样品提取液在pH=1.0缓冲液（氯化钾溶液）和pH=4.5缓冲液（醋酸钠溶液）中520nm和700nm的吸光值。
- 计算吸光度示差值
A = (A₅₂₀(pH1) - A₇₀₀(pH1)) - (A₅₂₀(pH4.5) - A₇₀₀(pH4.5))。此差值A代表了由花色苷产生的有效吸光度。
- 根据差值A计算总花色苷含量，以当量的矢车菊素-3-O-葡糖苷表示。
6. 试剂和材料：
- 主要试剂：
- 试剂配制 (关键)：
- 盐酸溶液 (1 mol/L): 16.66 mL浓盐酸定容至200mL。
- 提取液: 甲醇与1 mol/L盐酸溶液按体积比 85:15 混合 (如850mL甲醇 + 150mL盐酸溶液)。
- 氯化钾缓冲液 (pH=1.0): 14.9g KCl溶于1L水，用1 mol/L HCl调pH至1.0 (现用现配)。
- 醋酸钠缓冲液 (pH=4.5): 16.4g CH₃COONa溶于1L水，用1 mol/L HCl调pH至4.5 (现用现配)。
- 用水要求: 符合GB/T 6682的一级水。
7. 仪器设备：
- 分光光度计 (波长范围380-880nm)
- 分析天平 (感量0.001g)
- 磨粉机 (用于干燥样品)
- 匀浆机 (用于高水分样品)
- 离心机 (转速≥6000 r/min)
- 摇床
- 50 mL离心管 (具盖)
- 比色皿 (光程1 cm)
8. 分析步骤：
- 7.1 试样制备：
- 低水分样品 (如黑米、黑豆): 四分法取样，磨粉机粉碎，过250μm筛，-18℃保存备用。
- 高水分样品 (如杨梅、蓝莓、葡萄、茄子): 切碎混匀，四分法取约200g匀浆，-18℃保存备用。
- 7.2 总花色苷提取：
- 称样： 低水分样品称0.5g (精确至0.001g)；高水分样品称5.0g (精确至0.001g)。置于50mL离心管中。
- 提取： 加入10mL提取液，混匀，摇床振荡20min。
- 离心： 6000 r/min离心10min。
- 收集上清： 将上清液倒入另一50mL具盖离心管。
- 二次提取： 向残渣管中再加入10mL提取液，重复振荡、离心步骤。
- 定容： 合并两次上清液，用提取液定容至25mL，作为待测液。
- 7.3 测定：
- pH=1.0体系测定：
- 空白调零： 取2.5mL纯提取液，用氯化钾缓冲液(pH1.0)定容至25mL (DF=10)。以此溶液在520nm和700nm处分别调零。
- 样品测定： 取2.5mL 样品待测液，用氯化钾缓冲液(pH1.0)定容至25mL (DF=10)，混匀。在10分钟内，用1cm比色皿测定520nm和700nm吸光值，记为 A₅₂₀ 和 A₇₀₀。
- pH=4.5体系测定：
- 空白调零： 取2.5mL纯提取液，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)定容至25mL (DF=10)。以此溶液在520nm和700nm处分别调零。
- 样品测定： 取2.5mL 样品待测液，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)定容至25mL (DF=10)，混匀。在10分钟内，用1cm比色皿测定520nm和700nm吸光值，记为 A'₅₂₀ 和 A'₇₀₀。
9. 结果计算：
- 计算吸光度示差值
A：
A = (A₅₂₀ - A₇₀₀) - (A'₅₂₀ - A'₇₀₀)
A₅₂₀, A₇₀₀: 样品在pH1.0缓冲体系中的吸光值。A'₅₂₀, A'₇₀₀: 样品在pH4.5缓冲体系中的吸光值。
- 计算总花色苷含量
ω (以当量的矢车菊素-3-O-葡糖苷计, g/kg)：
ω = (A × MW × DF × V) / (ε × L × m)
ω: 样品中总花色苷含量，单位g/kg。A: 吸光度示差值（由公式1计算得出）。MW: 矢车菊素-3-O-葡糖苷的分子质量，为 449.2 g/mol。DF: 测定时待测液的稀释倍数（本方法中为 10）。V: 样品提取后定容的总体积，单位mL（本方法中为 25 mL）。ε: 矢车菊素-3-O-葡糖苷的摩尔吸光值，为 26900 L/(cm·mol) (在pH1.0缓冲液中，520nm处)。L: 比色皿光程，单位cm（本方法中为 1 cm）。m: 试样的质量，单位g（低水分样品0.5g，高水分样品5.0g）。
- 结果表示：
- 计算结果取两次平行测定的算术平均值。
- 计算结果保留三位有效数字。
10. 精密度：
- 在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10%。
总结核心要点：
- 该标准提供了一种基于pH示差的分光光度法，用于测定多种植物源性食用农产品（谷物、薯类、果蔬）中的总花色苷含量。
- 方法核心在于利用花色苷在低pH(pH1.0)显色和高pH(pH4.5)褪色的特性，通过测量两个pH缓冲体系中520nm(最大吸收)和700nm(背景干扰)的吸光度差值，有效扣除背景干扰，得到仅由花色苷产生的吸光度(
A)。
- 计算结果以当量的矢车菊素-3-O-葡糖苷表示。
- 样品前处理根据水分含量高低区分：低水分样品需粉碎过筛，高水分样品需匀浆。
- 样品提取使用甲醇-盐酸(85:15) 混合液，进行两次提取。
- 测定前需将提取液稀释10倍(DF=10) 到两种不同的pH缓冲液中。
- 计算结果需取平行测定平均值，保留三位有效数字。
- 方法精密度要求重复性相对偏差≤10%。
