T/SHNX 001-2025 生牛乳中乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋 白的测定液相色谱-串联质谱法

以下是对《T/SHNX 001—2025 生牛乳中乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定 液相色谱-串联质谱法》团体标准主要内容的详细总结：

​​一、基本信息​​

1. ​​标准编号与名称​​

   • T/SHNX 001—2025
   • ​​中文名称​​：生牛乳中乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定 液相色谱-串联质谱法
   • ​​英文名称​​：Determination of lactoferrin, α-lactalbumin and β-lactoglobulin in raw milk by LC-MS/MS

2. ​​发布与实施​​

   • 发布日期：2025年4月3日
   • 实施日期：2025年5月3日
   • 发布机构：上海奶业行业协会

3. ​​归口与起草单位​​

   • ​​归口单位​​：上海奶业行业协会
   • ​​起草单位​​：
     • 上海市农产品质量安全中心
     • 上海市动物疫病预防控制中心
     • 光明牧业有限公司
     • 光明乳业股份有限公司
     • 上海市质量监督检验技术研究院
     • 上海奶业行业协会
     • 上海必诺检测技术服务有限公司
     • 上海农林职业技术学院

​​二、适用范围​​

• ​​检测目标​​：生牛乳中的乳铁蛋白（Lactoferrin）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）。
• ​​方法​​：基于酶解-液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）的定量分析。

​​三、方法原理​​

1. ​​酶解处理​​：
   • 样品中的目标蛋白经胰蛋白酶水解，生成特征性肽段。
2. ​​LC-MS/MS检测​​：
   • 通过色谱分离目标肽段，质谱多反应监测（MRM）模式定量。
3. ​​定量方式​​：
   • 基质匹配标准曲线外标法（以鸡蛋蛋清粉配置空白基质溶液）。

​​四、关键试剂与材料​​

1. ​​核心试剂​​：
   • 碳酸氢铵（100 mmol/L）、二硫苏糖醇（500 mmol/L）、碘代乙酰胺（500 mmol/L）、胰蛋白酶（100 μg/mL）。
   • 标准品：乳铁蛋白（≥95%）、α-乳白蛋白（≥95%）、β-乳球蛋白（≥95%）。
2. ​​空白基质溶液​​：
   • 鸡蛋蛋清粉（0.10 g定容至50 mL水）用于消除基质干扰。
3. ​​标准溶液配制​​：
   • 标准储备液（1 mg/mL）→混合标准中间液（200 μg/mL）→系列工作液（1.0–200.0 μg/mL）。

​​五、仪器设备​​

• ​​主要设备​​：
  • 液相色谱-串联质谱仪（电喷雾离子源，ESI⁺）。
  • 色谱柱：C₁₈柱（100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm, 300 Å）。
  • 冷冻离心机（≥10,000 r/min）、恒温振荡箱/水浴锅、超声波仪。

​​六、样品前处理步骤​​

1. ​​样品制备​​：
   • 取2±0.02 g生牛乳试样，加水定容至50 mL。
2. ​​酶解流程​​：
   • 取200 μL样品液 → 加150 μL碳酸氢铵 + 15 μL二硫苏糖醇 → ​​60℃反应1 h​​ → 加30 μL碘代乙酰胺 → ​​暗处静置0.5 h​​ → 加50 μL胰蛋白酶 → ​​37℃酶解过夜​​。
3. ​​终止与净化​​：
   • 加10 μL甲酸终止反应 → 加水稀释 → 10,000 r/min离心5 min → 过0.22 μm滤膜。

​​七、仪器分析条件​​

​​表1：梯度洗脱程序​​

​​表2：MRM监测参数​​

​​八、结果计算​​

• ​​公式​​：

  \omega = \frac{\rho \times V \times f \times 100}{m \times 1000} 

  • \omega：目标蛋白含量（mg/100g）
  • \rho：试样溶液中被测物浓度（μg/mL）
  • V：试样定容体积（50 mL）
  • f：稀释倍数（酶解后稀释倍数为5倍）
  • m：试样质量（2 g）

• ​​结果表示​​：

  • 两次独立测定结果的算术平均值，保留3位有效数字。

​​九、方法性能指标​​

1. ​​精密度​​：
   • 重复性条件下两次测定结果的绝对差值 ≤ 算术平均值的10%。
2. ​​灵敏度​​（取样量2 g时）：
   • ​​检出限（LOD）​​：1 mg/100g
   • ​​定量限（LOQ）​​：3 mg/100g

​​十、附录​​

• ​​附录A（资料性）​​：
  • 提供乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白标准溶液（10 μg/mL）的离子质量色谱图（图A.1），用于保留时间和峰形参考。

​​关键说明​​

1. ​​专利声明​​：文件可能涉及专利，但发布机构不承担识别责任。
2. ​​标准依据​​：按GB/T 1.1—2020《标准化工作导则》起草。
3. ​​特殊要求​​：
   • 酶解需严格控制时间和温度；
   • 标准曲线必须用空白基质溶液配制以匹配样品基质。

此标准为生牛乳中三种功能性乳蛋白的高灵敏度定量提供了标准化方法，适用于乳制品企业、检测机构及质量控制部门。