DB21/T 4431-2026 梅花鹿体内胚胎生产与移植技术规程

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　　辽 宁 省 地 方 标 准

　　DB21/T 4431—2026

　　梅花鹿体内胚胎生产与移植技术规程

　　Code of pract ice for in vivo embryo product ion and transfer in s ika deer

　　2026 - 05 - 07 发布 2026 - 06 - 07 实施

　　辽宁省市场监督管理局 发 布

　　前 言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。

　　本文件起草单位：辽宁省农业农村发展服务中心、桓仁强风鹿业科研繁育基地。

　　本文件主要起草人：邓福金、关春梁、杨术环、王化青、杜学海、江馗语、王超、李静、关伟国、杨鹏、詹克宇、金洪艳、樊琳琳。

　　本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。

　　归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅(沈阳市和平区太原北街 2 号)，联系电话：024-23447862。

　　本文件起草单位通讯地址 : 辽宁省农业农村发展服务中心(沈阳市皇姑区陵园街7-1号)，联系电话：024-81845015。

　　梅花鹿体内胚胎生产与移植技术规程

　　1 范围

　　本文件规定了供体鹿的选择与饲养管理、同期发情超数排卵与人工授精、胚胎采集与胚胎质量鉴定、胚胎冷冻保存与解冻、胚胎移植与妊娠检查技术操作的要求，描述了记录过程。

　　本文件适用于梅花鹿体内胚胎生产与移植技术操作。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　DB21/T 1835 梅花鹿饲养管理技术规程

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 供体鹿的选择与饲养管理

　　4.1 供体鹿的选择

　　应满足以下条件：

　　a) 品种优良，生产性能高，经济价值大;

　　b) 三代系谱完整，繁殖机能正常，遗传性能稳定;

　　c) 3岁～5岁经产母鹿，体质健康，营养状况良好。

　　4.2 供体鹿的饲养管理

　　应满足以下条件：

　　a) 单圈饲养，保持安静的环境;

　　b) 超数排卵前28 d～30 d应进行短期优饲，每只每天补饲胡萝 卜0.25 kg，精料饲喂量及配方遵守DB21/T 1835中的规定;

　　c) 同期发情处理后，肌肉注射维生素ADE，剂量参见产品说明;

　　d) 超数排卵前28 d，不应注射疫苗。

　　5 供体鹿的同期发情、超数排卵与人工授精

　　5.1 器材和药品

　　5.1.1 器材

　　见附录 A 中 A.1。

　　5.1.2 药品

　　见附录 A 中 A.2。

　　5.2 同期发情与超数排卵

　　5.2.1 供体鹿的同期发情处理

　　在发情周期的任意一天将 CIDR 植入母鹿阴道深处(埋栓)，在埋栓后第 11 天换栓、第 13 天撤栓。

　　5.2.2 供体鹿的超数排卵处理

　　在埋栓后第 11 天开始肌肉注射 FSH，每天早、晚各 1 次，间隔 12 h，共 8 次，剂量递减，总剂量10.00 mL，在第 6 次肌肉注射 FSH 的同时肌肉注射 PG-CI 0.15 mg，撤栓后第 30 小时～第 36 小时肌肉注射 LHRH-A3 25 µg。FSH 注射程序见表 1。

　　表 1 FHS 注射程序

　　5.3 人工输精

　　5.3.1 冷冻精液

　　精子活力≥35%(即 0.35)，每支细管含有前向运动精子数量≥1000 万个。

　　5.3.2 试情与输精

　　5.3.2.1 撤栓后 12 h 开始试情，母鹿接受爬跨视为发情。

　　5.3.2.2 发情母鹿于撤栓后第40 小时～第 44 小时输精一次。

　　5.3.3 输精方法

　　应遵守 GB/T 45209 规定的要求。

　　5.4 记录

　　填写供体同期发情、超数排卵与人工授精记录表，见附录B中表B.1。

　　6 胚胎采集与胚胎质量鉴定

　　6.1 基本要求

　　6.1.1 现场条件

　　6.1.1.1 具有相对独立的采胚室、检胚室、胚胎冷冻室。

　　6.1.1.2 采胚室宽敞明亮、无灰尘，并配有照明、上下水、工作台、保定架等设施，宜与检胚室相邻。

　　6.1.1.3 采胚室和检胚室配备温度控制和紫外消毒设备，温度宜控制在18 ℃~25 ℃ , 采胚前一天用紫外线灯照射30 min～40 min。

　　6.1.2 器材消毒

　　凡是接触鹿的器材，如手术剪、手术刀、宫颈钳、打孔器、镊子、创布、毛巾、纱布等，洗净后放入(金属器械用布包好)高压灭菌器中，温度 121 ℃~126 ℃ , 维持 30min，消毒后置于无菌箱中备用。

　　6.1.3 人员准备

　　操作人员应穿好工作服，戴好工作帽和医用乳胶手套，双手用0.1%新洁尔灭溶液消毒。

　　6.1.4 供体准备

　　供体应在手术前24 h断水断料，避免应激。

　　6.2 器材、药品和试剂

　　6.2.1 器材

　　见附录 A 中 A.3。

　　6.2.2 药品和试剂

　　见附录 A 中 A.4。

　　6.2.3 冲胚液和保存液

　　冲胚液配制见附录C中C.1，保存液配制见附录C中C.2。或者使用商品冲胚液、保存液。

　　6.3 胚胎采集

　　6.3.1 胚胎采集时间

　　人工输精后的第6天进行。

　　6.3.2 胚胎采集步骤

　　6.3.2.1 用吹管、吹针、麻醉药将供体麻倒，头朝前呈水平仰卧姿势保定在保定架上，拉出舌头，戴上头套，运到采胚室。

　　6.3.2.2 位于乳房前4 cm、腹中线两侧20 cm区域，先用剃毛剪剔除皮肤的被毛，再用剃须刀刮净。用湿毛巾擦净，先用5%碘酊消毒，再用75%酒精脱碘处理。

　　6.3.2.3 升起保定架一端，呈前低后高姿势,术部固定好创布。

　　6.3.2.4 在乳房前4 cm，沿腹中线用手术刀切约5 cm切口，用宫颈钳将子宫角及卵巢牵出，观察左右卵巢上的黄体发育情况，记录黄体数目。

　　6.3.2.5 卵巢上没有黄体或黄体数量少于3个(包括3个)，不进行冲胚;卵巢上有3个以上黄体，在子宫角基部(上1/3处)用止血钳穿孔，插入冲胚管，由冲胚管的充气孔注入3 mL～5 mL冲胚液，使气囊封阻子宫腔。在子宫角的上端(子宫角和输卵管结合部)用打孔器打一小眼，插入套管针，将套管针向输卵管方向插入，拔出针芯，将装有冲胚液的20 mL注射器接到套管针上，注入2针管共40 mL冲胚液(手术前置于35 ℃~37 ℃水浴箱中)，将胚胎由冲胚管的出液孔收集于培养皿 ( Φ90 mm) 中，用记号笔在培养皿上做好标记。抽出气囊中液体，取下冲胚管，用同样的方法冲取另一侧子宫角的胚胎。

　　6.3.2.6 用含青霉素的生理盐水(500 mL生理盐水加入青霉素400万单位)冲洗子宫角，放回腹腔。

　　6.3.2.7 创口用缝合针和可吸收性外科缝合线缝合两层，腹膜和肌肉层连续缝合，皮肤结节缝合，外涂5%碘酊，肌肉注射兽用土霉素160万单位和PG-CI 0.2 mg。

　　6.3.2.8 将供体鹿运回鹿舍，肌肉注射麻醉解药，剂量是麻醉药的2.5倍。

　　6.4 胚胎检查

　　6.4.1 在20 ℃~25 ℃环境条件下，将盛有冲胚液的培养皿放在28 ℃~30 ℃恒温板上，静置10min，让其自然沉降。

　　6.4.2 在体式显微镜8倍～10倍镜下，将寻找到的胚胎用连有移胚针的1 mL注射器或吸胚管移入盛有保存液的培养皿 ( Φ35 mm)中，同一供体的胚胎应放在一个培养皿内，并记录。

　　6.5 胚胎洗涤

　　6.5.1 将同一供体的胚胎从保存液中吸出移到另一个培养皿中的保存液中，洗涤1次～2次。

　　6.5.2 每次洗涤保存液应不少于200 µL ，每组洗涤胚胎数不应超过10枚，每次洗涤应更换移胚针、注射器或吸胚管，每次洗涤胚胎带入培养皿中的液体量不应超过1%。

　　6.6 胚胎质量鉴定

　　6.6.1 胚胎洗涤后，置于体式显微镜50倍以上镜下观察胚胎发育状态，确定胚胎等级。

　　6.6.2 胚胎发育期划分应按照GB/T 25881的规定执行。

　　6.6.3 胚胎等级划分应按照NY/T 1674的规定执行。

　　6.6.4 胚胎分为A、B、C、D四个等级，其中A、B、C级为可用胚胎，D级为不可用胚胎。

　　6.7 记录

　　胚胎采集及质量鉴定后，应由操作人员及时填写胚胎采集与胚胎质量鉴定记录表，见附录B中表B.2。

　　7 胚胎的冷冻、保存与解冻

　　7.1 器材

　　见附录 A 中 A.5。

　　7.2 胚胎的冷冻

　　7.2.1 冷冻液

　　配制见附录C中C.3。或者使用商品冷冻液。

　　7.2.2 胚胎要求

　　胚胎应处于桑葚胚至囊胚阶段，胚胎质量应为A级、B级。

　　7.2.3 胚胎冷冻操作步骤

　　7.2.3.1 胚胎的洗涤

　　把胚胎放进冷冻液中洗涤 2 次，在第 3 次洗涤时装入细管。

　　7.2.3.2 胚胎的装管

　　洗涤后应迅速用吸卵器或移胚针将胚胎装入0.25 mL 细管，时间不应超过40 min。每支细管宜装 1枚～2 枚胚胎，胚胎装入细管顺序：冷冻液(约 1.6 cm) →气泡(约 0.5 cm) →冷冻液(约 1.6 cm) →气泡(约 0.5 cm) →含胚胎冷冻液(约 2.5 cm) →气泡(约 0.5 cm) →冷冻液(约 1.6 cm) →气泡(约0.5 cm) →冷冻液(约 1.6 cm)，用经酒精灯加热的止血钳热塑封口(或使用封口器封口)。胚胎装管示意图见图 1。

　　图 1 胚胎装管示意图

　　7.2.3.3 胚胎细管的标识

　　胚胎细管应标识细管号、胚胎数量、胚胎发育期、胚胎等级、供体品种、供体号、公鹿品种、公鹿号、生产日期和生产单位等内容，示例见附录 D 中 D.1。

　　7.2.3.4 胚胎冷冻步骤

　　胚胎冷冻操作步骤如下：

　　a) 将胚胎冷冻仪预先冷却至-6.0 ℃~-5 ℃ ;

　　b) 将装有胚胎的细管棉塞端朝下插入冷冻槽内平衡4 min～5 min;

　　c) 用经液氮冷却后的镊子夹细管封口端植冰;

　　d) 植冰后平衡 5 min～10 min;

　　e) 以 0.3 ℃/min～0.6 ℃/min 的速率降温至-32 ℃~-35 ℃ , 投入液氮。

　　7.2.3.5 记录

　　胚胎冷冻结束后，应由操作人员填写冷冻胚胎生产记录表，见附录 B 中表 B.3。

　　7.3 胚胎的保存

　　7.3.1 冷冻胚胎细管宜装入拇指管内，拇指管应标识供体号、公鹿号、细管数量、生产日期、生产单位，示例见附录D中D.2。

　　7.3.2 冷冻胚胎细管应保存在液氮罐的液氮中。

　　7.3.3 存放冷冻胚胎细管的液氮罐应符合GB/T 5458的规定。

　　7.4 胚胎的解冻

　　胚胎解冻操作步骤如下：

　　a) 从液氮灌中取出冷冻胚胎细管;

　　b) 在空气中(18 ℃~25 ℃) 停留 5 s～7 s;

　　c) 投入 32 ℃~35 ℃水浴中停留 30 s～45 s;

　　d) 从水浴中取出胚胎细管，用灭菌纸巾擦干细管表面水珠，再用酒精棉球擦拭细管表面;

　　e) 用细管剪剪去胚胎细管封口，将胚胎细管中的冷冻液及胚胎推出到培养皿中;

　　f) 在体式显微镜下镜检合格的胚胎再进行移植。

　　8 胚胎移植与妊娠检查

　　8.1 受体鹿的选择与饲养管理

　　8.1.1 受体鹿的选择

　　应满足以下条件：

　　a) 2 岁～4 岁经产鹿，生产性能较低;

　　b) 体质健康，繁殖机能正常;

　　c) 膘情适中，体型相对较大;

　　d) 母性好，无恶癖。

　　8.1.2 受体鹿的饲养管理

　　应符合4.2 中的相关规定。

　　8.2 受体鹿的同期发情

　　8.2.1 器材和药品

　　8.2.1.1 器材见附录A中A.1。

　　8.2.1.2 药品见附录A中A.2。

　　8.2.2 同期发情处理

　　8.2.2.1 移植新鲜胚胎。受体鹿与供体鹿同一天埋栓(CIDR)和撤栓(CIDR)，撤栓同时肌肉注射PMSG 330 IU。

　　8.2.2.2 移植冷冻胚胎。受体鹿在发情周期任意一天埋栓，在埋栓后第12天～第14天撤栓，撤栓同时肌肉注射PMSG 330 IU。

　　8.3 胚胎移植

　　8.3.1 器材和药品

　　8.3.1.1 器材见附录A中A.6。

　　8.3.1.2 药品见附录A中A.7。

　　8.3.2 移植时间

　　8.3.2.1 新鲜胚胎移植应与供体胚胎采集同一天进行。移植前胚胎需要重新鉴定一次，鉴定合格后4h内完成移植。

　　8.3.2.2 冷冻胚胎移植应在受体鹿撤栓后第8天～第9天进行。胚胎解冻后需要重新鉴定一次，鉴定合格后20 min内完成移植。胚胎解冻方法应符合7.4中的相关规定。

　　8.3.3 移植要求

　　挑选卵巢上有黄体的受体进行胚胎移植。

　　8.3.4 胚胎要求

　　8.3.4.1 移植的新鲜胚胎质量应达到C级(含C级) 以上。

　　8.3.4.2 移植的冷冻胚胎质量应达到B级(含B级) 以上。

　　8.3.5 移植方法

　　8.3.5.1 术前准备

　　受体手术前 24 h 断水断料，避免应激。

　　8.3.5.2 胚胎移植操作

　　步骤如下：

　　a) 符合 6.3.2.1 中的相关规定;

　　b) 符合 6.3.2.2 中的相关规定;

　　c) 符合 6.3.2.3 中的相关规定;

　　d) 在乳房前4 cm、腹中线两侧 10 cm 处用手术刀各切约 1 cm 切口，一侧插入打孔器和内窥镜，另一侧插入宫颈钳，通过内窥镜和宫颈钳相互配合观察左右卵巢上的黄体发育情况;

　　e) 把卵巢上有黄体一侧子宫角用宫颈钳拉出，在子宫角基部(上 1/3 处)用打孔器打一小孔，用连接有移胚针的 1 mL 注射器把含有胚胎的0.1 mL～0.2 mL 的保存液注入子宫内;

　　f) 符合 6.3.2.6 中的相关规定;

　　g) 左右创口各缝合 1 针，外涂 5%碘酊，同时肌肉注射青霉素 160 万单位或兽用土霉素注射液 100万单位和黄体酮 50 mg;

　　h) 移植鹿运回鹿舍，注射麻醉解药，单独饲养，精心照顾。

　　8.4 妊娠检查

　　在胚胎移植后45 d～50 d 用超声波仪进行检查，确定母鹿是否怀孕及胚胎发育情况。

　　8.5 记录

　　胚胎移植和妊娠检查后，应由操作人员填写受体胚胎移植与妊娠检查记录表，见附录 B 中表 B.4。

　　9 证实方法

　　梅花鹿体内胚胎生产与移植过程中应保留各环节的记录表、照片和影像等。

　　查验环节的记录表、照片和影像包括：

　　a) 供体同期发情、超数排卵与人工授精记录表;

　　b) 胚胎采集与胚胎质量鉴定记录表、照片及影像;

　　c) 冷冻胚胎生产记录表;

　　d) 受体胚胎移植与妊娠检查记录表、照片及影像。

　　附 录 A

　　(资料性)

　　器材、药品及试剂

　　A.1 同期发情、超数排卵与人工授精所需主要器材

　　吹管(内径 2 cm、长 135 cm)、吹针(2 mL)、一次性注射器(2 mL、5 mL)、恒温水浴箱(20 ℃~ 50 ℃) 、细管剪、输精枪(0.25 mL)、输精枪外套、一次性长臂塑料手套等。

　　A.2 同期发情、超数排卵与人工授精所需主要药品

　　麻醉药(主要成分盐酸赛拉嗪，规格为2 mL/支)、麻醉解药(主要成分盐酸苯噁唑，规格为2mL/支)、羊用孕酮阴道栓(CIDR，孕酮含量为300 mg/个)、促卵泡素(FSH，规格为500 IU/支)、氯前列烯醇钠(PG-CI，规格为0.2 mg /支)、促黄体素释放激素A3(LHRH-A3,规格为25 µg/支)、生理盐水等。

　　A.3 手术法胚胎采集与胚胎质量鉴定所需器材

　　吹管、吹针、体视显微镜(0.8x～8x)、腹腔内窥镜、恒温水浴箱、高压灭菌器、恒温板(28 ℃)、自制保定架、打孔器、套管针(22G)、冲胚管(8Fr 或 10Fr)、一次性注射器(1 mL、2 mL、5 mL、 20 mL)、一次性无菌培养皿 ( Φ90 mm、 Φ35 mm)、剃毛剪、剃须刀、手术剪(13 cm)、手术刀、缝合针、可吸收性外科缝合线、止血钳、宫颈钳、移胚针、记号笔、医用乳胶手套、创布、无菌纱布等。

　　A.4 手术法胚胎采集与胚胎质量鉴定所需药品及试剂

　　麻醉药(盐酸赛拉嗪)、麻醉解药(盐酸苯噁唑)、冲胚液、保存液、冷冻液、0.1%新洁尔灭溶液、 75%酒精、生理盐水、5%碘酊、青霉素(规格为 160 万单位/支)、兽用注射用土霉素(规格为 200 万单位/支)、氯前列烯醇钠(PG-CI，规格为 0.2 mg /支)等。

　　A.5 胚胎冷冻、保存与解冻所需器材

　　体视显微镜(0.8x～8x)、恒温板(10 ℃~40 ℃) 、胚胎冷冻仪、液氮罐(30 L)、液氮、细管

　　(0.25 mL)、拇指管 ( Φ 13 mm)、移胚针、一次性注射器(1 mL)、一次性培养皿 ( Φ35 mm、Φ90 mm)、记号笔、酒精灯、镊子、封口器。

　　A.6 胚胎移植与妊娠检查所需主要器材

　　吹管、吹针、一次性注射器(1 mL、2 mL)、移胚针、液氮罐、保定架、腹腔内窥镜、镊子、剃毛剪、剃须刀、手术刀、缝合针、可吸收性外科缝合线、套管针、宫颈钳、兽用B超仪、医用乳胶手套等。

　　A.7 胚胎移植与妊娠检查所需主要药品

　　麻醉药(盐酸赛拉嗪)、麻醉解药(盐酸苯噁唑)、保存液、75%酒精、5%碘酊、黄体酮(规格为 50 mg/支)、青霉素(规格为 160 万单位/支)、兽用注射用土霉素(规格为 200 万单位/支)、0. 1%新洁尔灭溶液。

　　附 录 B (资料性)

　　梅花鹿体内胚胎生产与移植记录表

　　B.1 供体鹿同期发情、超数排卵与人工授精记录表见表 B.1。

　　表 B.1 供体鹿同期发情、超数排卵与人工授精记录表

　　B.2 胚胎采集与胚胎质量鉴定记录表见表 B.2。

　　表 B.2 胚胎采集与胚胎质量鉴定记录表

　　B.3 冷冻胚胎生产记录表见表 B.3。

　　表 B.3 冷冻胚胎生产记录表

　　B.4 受体鹿胚胎移植记录表见表 B.4。

　　表 B.4 受体鹿胚胎移植记录表

　　附 录 C

　　(资料性)

　　主要液体配制

　　C.1 冲胚液

　　C.1.1 磷酸盐缓冲液(PBS)，配方见表 C.1。

　　C.1.2 使用时宜在 PBS 液中添加 100 000 U/L 青霉素和 50 000 U/L 链霉素。

　　C.1.3 使用时应在 PBS 液中添加 1%(V/V)犊牛血清或胎牛血清，或 0.04% BSA(牛血清白蛋白，m/V)。

　　C.2 保存液

　　10%(V/V)胎牛血清或 0.4% BSA(m/V)的 PBS 液。

　　C.3 冷冻液

　　1.5 mol/L 乙二醇的保存液(含 0.1 mol/L 蔗糖)。

　　表 C.1 PBS 配方

　　附 录 D

　　(资料性)

　　胚胎细管与拇指管标识

　　D.1 胚胎细管标识

　　D.1.1 胚胎细管应标识细管号、胚胎数量、胚胎发育期、胚胎等级、供体品种、供体号、公鹿品种、公鹿号、生产日期和生产单位。

　　D.1.2 胚胎细管标识可用记号笔或喷码机在细管表面标注或打印，示例见图 D.1。

　　图 D.1 胚胎细管标识示例

　　D.2 拇指管标识

　　D.2.1 贮存冷冻胚胎细管的拇指管应标识供体号、公鹿号、细管数量、生产日期、生产单位。

　　D.2.2 拇指管标识可用记号笔在拇指管表面标注，示例见图D.2。

　　图 D.2 拇指管标识示例